157578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás "tuberaktin" elnevezésű antibiotikum előállítására
15 157578 16 3. példa: , 2% glükózt, 3% keményítőt, 1,4% száraz élesztőt és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó tápoldátot készítettünk, és abban a tenyésztést 5 az 1. példa szerinti módon folytattuk le. Ilyen módon 1 liter folyékony tápoldatot kaptunk, amely 1575 mcg/ml koncentrációban tartalmazott tufceraktint. A folyadékot az 1. példa szerinti módon to- IQ viább kezelve, 1,11 g nyers tuberaktin-hidrokloridot kaptunk. Tisztaság: 71%; hozam: 57%. 4. példa: 15 1% keményítőt, 1% melaszt, 1% peptönt, 1% húskivonatot és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó, 7,0 ipH-jú 100 ml tápoldatot készítettünk amelyet frákcionáltan 500 ml űrtartalmú 2 o Sákagudhi-lombikba adagoltunk, majd 120 C°on 30 percen át a lombikot sterilizáltuk. Storeptomyces griseoverticillátus var. tuberacticus-t oltottunk a frakcionált közegekbe, és 7 cm amplitúdóval percenként 130 rezgést végző rázó- „5 gépen 30 C°-o'n két napon át tenyésztést Végeztünk. Az így kapott 400 ml tápoldatot csíramentes körülményék között 20 liter olyan tápközegbe vittük át, amely 1% keményítőt, 1% melaszt,' 1% paptont, 1% húskivonaíot és „„ 0,5% nátriumkloridot, továbbá 5 ml toabgátló anyagot („UNIOL D—2000"; a tokiói Nissan . Yushi K. K. készítménye) tartalmazott. Ezt a táptalajt 30 literes fermentorba vittük át majd 120 C°-on 30 percen át sterilizáltuk. Az így ké- _ szített fermentáló keveréket 30 Cc -on 24 órán át 200 fordulat/perc sebességű rotációs rázó- _ gépen tenyésztettük, miközben 20 liter/perc sebességgel levegőztettük és egyúttal kevertük. A levegőztetésre és keverésre használt levegőt előzetesen sterilizáltuk. . A fermentált keveréket 3%, keményítőt, 2% glükózt, 1,5% melaszt, 1,5% szójababport és 0,5%, nátriumkloridot tartalmazó fermentációs közeghez adtuk, amelyhez még 100 ml habgát- 4 ló anyagot is adagoltunk. Ezt a keveréket 250 liter űrtartalmú és rozsdamentes acélból készített' sterilizált fermentációs tartályba adagoltuk. A tartályt 30 C°-on 90 órán át fermentáltuk 300 ford./perc forgatási sebesség és 100 50 liter/perc levegőztetési sebesség mellett. Ilyen módon 190 liter fermentációs folyadékot kaptunk, amely a tuberaktint 2100 mcg/ml koncentrációban tartalmazta. A fermentációs folyadék pH-ját sósav hozzáadásával 2,0-ra állítottuk be majd 2,5% kovaföldet adtunk hozzá. Ezután a micéliumot és a szilárd szennyezéseket leszűrtük. Az így kapott 160 liter folyadékot nátriumhidroxid oldattal semlegesítettük, majd 30 liter/óra sebességgel 60 olyan oszlopon vezettük keresztül, amely 15 liter nátrium-típusú „Amberlite IRC—50" ioncserélő gyantával volt megtöltve. Az .oszlopot vízzel mostuk, majd a gyanta által megkötött tuber- 65 aktint 5 liter/óra sebességgel átfolyatott 1 n sósav oldattal leoldottuk. A kifolyó oldatot 2,5 litereriként frakcionáltuk. A hatékony vegyületet a 7—12. frakciók tartalmazták. Ezeket a frakciókat egyesítettük, nátronlúg oldattal semlegesítettük, vákuumban kb.. 500 iril-re betöményítettü'k, és a képződött nátriumkloridot szűréssel elkülönítettük. A kondenzátumot aktívszénnel színtelenítettük majd hozzáadtunk 4 liter metanolt, és éjjelein iát 5 C°-on állni hagytuk. Az üledéket szűrtük, metanollal mostuk és vákuumban szárítottuk. Ilyen módon 320 g tubeiráktín-thidriokloridot kaptunk. Tisztaság: 70,5%. Hozam: 67,3%. 5. példa: Mindenben a 2. példa szerinti módon jártunk el, és 20 liter tápoldatot kaptunk, amely 1900 mcg/ml koncentrációban tartalmazott tuberaktint. A tenyészoldat pH-ját kénsav oldat hozzáadásával 2,0-ira alítottuk be, majd az oldatot kis mennyiségű szűrésgyorsító hozzáadása után szűrtük. Ilyen módon il,76 liter felülúszó folyadékot kaptunk amelynek pH-ját 5,5-re állítottuk be. Ezután 15 g „Erichrome violet"-et adtunk az oldathoz. Az elegyet 1,5 órán át kevertük, majd a leülepedett színezéksót szűrtük, vízzel mostuk, ezt követően pedig megszárítottuk. A szárított színezéksót szuszpendáltuk .olyan oldószerelegyben, amely 80% acetonból és 20% metanolból állt, és amelyhez mindaddig, amíg már nem volt megfigyelhető további tufoeraktinszulfát-ülepedés, 50%-os olyan metanol oldatot adtunk amely trimetilaminszullfátot tartalmazott. A reakoiőelegyet 1,5 órán át kevertük, majd a képződött üledéket szűrtük, és acetonnal és metanollal alaposan imostuk a színezék eltávolítása céljából. A lehető legkisebb menynyiségű víz hozzáadása után a nyers termékhez ismét metanolt adtunk a tuberaktin^szulfát újbóli ülepítése céljából. Ilyen módon 2,97 g nyers porterméket kaptunk. Tisztaság: 80%. Hozam: 60%. 6. példa: Az 1. példa szerinti módon kapott 100 mg tuberaktin^hidrokloridot oldottunk 5 ml olyan oldószerelegyben, amely 15 :10 : 3 :12 arányban tartalmazott n-butanolt, piridint, ecetsavat és vizet. Az oldatot azonos oldószerkeverékben szuszpendált cellulózporral töltött, 1 cm X130 cm méretű oszlopon vezettük át. Ezután 10 ml/óra sebességgel ugyanezt az aldószerelegyet vezettük keresztül az oszlopon, és a kifolyó oldatot 3 ml-enként frakcionáltuk. Megállapítottuk, hogy a 41—50. (frakciók tartalmaztak hatóanyagot. Ezeket a frakciókat egyesítettük és 8
