157552. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kristályos adenozin-5'-foszfát előállítására

3 157552 4 erre a célra alkalmas, mert ennek hatására az ademozin-riibóz N-glukozid-kötése elbomlik é.s így adenin és ribózHÍoszfátok keletkeznek. Nem alkalmas ipari kivitelezésre a fent említett okokból az isimert báriumihidroxidos hidrolízis sem, főként a keletkező szervetlen pirofoszfátok elválasztásával járó technikai nehézségek miatt. Meglepő módon azt találtuk, hogy ha a hidrolízist az irodalomban e célra leírt báriumhidroxid helyett — balcmmhidroxiddal végezzük, akkor az ismert hidrolízis-niódszerek esetében fennálló fent említett hátrányok teljesen kiküszöbölődnek. A hidrolízis ugyanis ebben az esetben más kémiai mechanizmus szerint megy végibe; a leihasadó foszfát csoportok nem pirofoszfát, hanem orto-ifpszfát alaík'ban jelennek meg a hidrolízisterméklben, ami az AMP termék elkülönítihetősége szempontjából igen fontos műszaki előnyt jelent, Az irodalomban leírt módon, báriumhidroxiddal lefolytatott hidrolízis termékében ugyanis a kívánt AMP báriumsója mellett főként báriumpiroifoszfát van jelen, ennek az oldhatósága viszont eléggé nagy és így elválasztása a kapott AMP-tól igen költséges és a nagyfokú adszorpció miatt igen veszteséges. Ezzel szemben a hidrolízis kalciumhidroxiddal való lefolytatása esetén a hidrolízistermékbein az AMP kalciumsója mellett főként kalcium-orto-ifoszfát képződik, amelynek oldhatósága egy nagyságrenddel alacsonyabb, mint az ismert eljárásikor keletkező báriu>m-<pirofoszfáté, így ez a melléktermék könnyen és teljesen szelektíven elválasztható az AMP kalciumsójától, amelyet tehát sokkal egyszerűbben különíthetünk el tiszta állapotban. Ezen túlmenően azonban számos más előnye van az ATP-t és ADP-t tartalmazó kiindulóanyag kalciuimihidroxiddal történő hidrolízisnek. A hidrolízis egyértelműen AMP-t ad termékként, a báriumhidroxidos hidrolízis esetében ismert különféle melléktermékek (pl. a túlságosan messzemenő hidrolízis folytán keletkező adenozin, stb.) gyakorlatilag nem keletkeznek, így már közvetlenül is lényegesen tisztább terméket kapunk. A hidrolízis kalciumhidroxiddál iparilag, lóhúskivonatból vagy más, különböző adenozkHfoszifátokat egymás mellett, kísérőanyagok jelenlétében tartalmazó természetes nyersanyagokból kiindulva, jól megvalósítható, a képződött AMP könnyen és jó tisztasági fokban választható el és egyszerű módszerékkel tisztítható tovább. Előnye még az eljárásinak az is, hogy teljesen mellőzi az erősen mérgező hatású Ba2^ ionok használatát. A találmány szerinti eljárás ipari megvalósítására igen alkalmas kiindulóanyag az alkohollal előkezelt és szárított lóhús fehérjementesített vizes kivonata, amely egyébként az ATP ipari előállítására is alkalmas. A lóhúst erre a célra a darált izom 1 súlyrészére számítva 2 tf.rész 96%-os etanollal kezelik, először hidegen 1 óra hosszat, majd újabb 2 tf.rész 96%os etanollal 20 percig hidegen, majd 5 percig forralva keverik. Az. így nyert alkohollal extrahált izommaradék szárítás után huzamos ideig tárofliható, hatóanyagveszteség nélkül. Az i alkohollal kivonatolt, szárított izommaradékot 5—5 sr. vízzel két lépésben kivonatolják, az 5 egyesített vizes kivonatot a fehérjék eltávolítása céljából hűtés köziben pH 3-ig megsavanyítják, szűrik, majd semlegesítik. Kromatográfiás méréseink szerint az így fehérjernentesített kivonat literenként átlagosan 0,64 g ATP-t, 10 0,2 g ADP-t ós 0,17 g AMP-t tartalmaz. Ebből eljárásunk szerint elméletileg 0,77 g/liter AMP állítható elő. Méréseink szerint átlagosan: 1 kg nyers lóhúsból 1,25 g ATP, 0,41 g ADP, 15 0,29 g AMP = 1,49 g elm. AMP, 1 kg szárított lóhúsból 5,2 g ATP, 1,7 g ADP, 1,2 g AMP = 6,2 g elm. • . AMP 20 kivonatolható. Megjegyzendő azonban, hogy az eljárás kiindulási anyagát képező kivonat hatóanyagtartalma általában alacsonyabb az izomra vonat-25 kozó irodalmi értékeknél. Ez részben a hús minőségétől, résziben a nagyüzemben végzett előkezelés kivitelezésétől függ. Az eljárás izomra számított hozama természetesen az izomkivonat hatóanyagtartalmától függ. A találmány szerinti eljárás kiinduloanyagaként alkalmazható nyers, egyébként tiszta ATP, vagy ADP, vagy pedig bármely oly termék is, amely az ATP mellett ADP-t és AMP-;t is tar^5

talmaz. Modellkísérleteinkben tiszta ATP, ill. ADP eljárásunk szerint végzett kalciumhidroxidos hidrolízise után azt találtuk, hogy a hidrolizátum szűrletében seim anorganikus foszfát, sem n. sósavoldatban 100 C°-on, 7 perc alatt hidrolizálható foszfát nem mutatható ki; a kiindulási anyag stabil foszfortartalmának azonban ATP esetében 94,6%-a, ADP esetében pedig 91,4%-a mérhető a szűrletlben (AMP ilyen mértékű keletkezésére mutató adat). Azt találtuk, hogy a kalciumhidroxiddál végzett hidrolízis végrehajtható az alkohollal extrahált izommaradék vizes kivonatával, vagy annak vákuumban bepároít bomoentrátumával (0,5—5,0 g/liter elm. AMP tartalom) egyaránt. Bepárlás esetén legoékzerűlbben a kb. 1/6 térfogatra kon-5Ü central! kivonat használható. (4—5 g/l elm. AMP.) Szubsztanciáiból való kiindulás esetén a várható AMP tartalomra nézve 0,5—1,5%-os vizes oldatból indulunk ki. 55 A hidrolízisre felhasznált oldat elméleti AMP tartalmát legcélszerűbb .a 257 mfi-mél mérhető uv. abszorpció alapján kiszámítani. (1 cm rétegvastagságnál mért extinkeió 23-mal szorozva adja az oldat adenin alapján mért elméleti AMP tartalmát, gamma/ml-iben.) Az így nyert adatok jó egyezést mutatnak a N-tartalomlból, valamint a papírkromatográfiiás elválasztás után uv. spektrofotometriás úton mért ATP, ADP és 65 AMP tartalomiból számított elméletileg kinyer-