157501. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citotetrinek előállítására
a 157501 6 a felhalmozódott citotetrineket kivonjuk, és adott esetben a kapott citotetrin komplexet öszszétevőire választjuk szét. A Streptomyces griseoflavus „CBS-Cifferi" törzs tenyésztésére a sugárgombák tenyésztésére szolgáló általánosan szokásos módszereket alkalmazhatjuk. A tenyésztésre szolgáló táptalajban a gomba által asszimilálható szén- és nitrogénforrások, szervetlen sók és egyéb járulékos alkotórészek (biosz anyagok, habzásgátló) vannak jelen. Szénforrásként használhatunk glükózt, szacharózt, laktózt, keményítőt vagy glicerint. A legelőnyösebb szénforrásnak a glükóz bizonyult. Nitrogénforrásként általában természetes eredetű anyagokat, szójalisztet, mogyorólisztet, fehérbablisztet, zablisztet, hallisztet, peptont, továbbá egyedüli nitrogénforrásként kukoricalekvárt, szervetlen nitrogénforrásként pedig káliumnitrátot, ammómumnitrátot, nátriumnitrátot stb. alkalmazhatunk. A legelőnyösebb nitrogénforrásnak a szójaliszt bizonyult. Szervetlen sóként káliumnitrát és egyéb nitrátok mellett nátriumkloridot, ammóniumszulfátot, ammóniumkloridot, különféle foszfátokat, ill. CaCOs-t stb. alkalmazhatunk. A termelő táptalajban kalciumkarbonátra nincs szükség, mert ennek jelenléte esetében az antibiotikumtermelés csökkenése tapasztalható. Járulékos alkatrészként a táptalaj kazeinhidrolizátumot, húskivonatot, élesztőkivonatot stb. tartalmazhat. A legjobban reprodukálható eredmények járulékos anyagként kazeinhidrolizátum alkalmazásával érhetők el. Habzásgátlóként növényi olajokat, célszerűen pálmaolajat alkalmazhatunk a szükségletnek megfelelő mennyiségben. Nyomelemek külön alkalmazására általában nincs szükség, mivel ezeket a táptalaj készítéséhez használt csapvíz elegendő mennyiségben tartalmazza. Igen fontos, hogy a táptalajban a szerves és szervetlen alkotórészek megfelelő arányban legyenek jelen. A szén- és nitrogénforrások, szervetlen sók, valamint egyéb járulékos alkatrészek felhasználása többféle táptalaj-összeállítást is lehetővé tesz. A szén- és nitrogénforrásokat önmagukban vagy keverékek alakjában is alkalmazhatjuk. A rázott kultúra, az inokulum fermentáció, illetve a termelő fermentáció táptalajigénye némiképpen éltérő, bár a. fő alkatrészek minősége mindhárom esetben azonos. A maximális antibiotikum-termelés glükózzal mint szénforrással érhető el. A glükóz felhasználása esetén az antibiotikum-termelés a nitrogénforrás minőségére csak kevéssé érzékeny. Pepton és kukoricalekvár kivételével bármely más, az előbbiekben felsorolt nitrogénforrás felhasználása gyakorlatilag azonos, magas antibiotikumtermelést biztosít. Más szénforrások felhasználása esetében a nitrogénforrás minősége már érzékenyen befolyásolja az antibiotikum képződését. Az egyes alapvető szénforrások alkalmazásánál a nitrogénforrás minősége az alábbiak szerinti sorrendben csökkenő antibiotikum termelési értékeket eredményez. Keményítő: fehérbabliszt, zabliszt, szójaliszt, mogyoróliszt, halliszt, pepton, kukoricalekvár. Szacharóz: zabliszt, fehérbabliszt, mogyoróliszt, szójaliszt, halliszt, pepton, kukoricalekvár. Glicerin: halliszt, zabliszt, mogyoróliszt, szójaliszt, babliszt, pepton, kukoricalekvár. Laktóz: csak a fehérbabliszt felhasználása ad megfelelő antibiotikum-termelést. A táptalajt a káliumnitrát és az egyéb nitrátsók kivételével (ezeket külön kell sterilezni, majd a sterilezett táptalajhoz adni) csap vízben oldva, illetve szuszpendálva együttesen sterilezzük 121°C-on 1 órán keresztül. Megfelelő antibiotikumtermelés elérése érdekében elengedhetetlen a megfelelő mértékű keverés és levegőztetés biztosítása. Különösen fontos az igen intenzív, az egész tápfolyadékra kiterjedő keverés, melyet megfelelő szerkezetű keverőberendezéssel lehet biztosítani. A fermentáció 40—48. órájában a táptalaj erősen besűrűsödik, és ha ilyenkor megfelelő keverésről nem gondoskodunk, a táptalaj egynemű masszaként forog és a levegőellátás lerombolása miatt a citotetrin-termelés erősen csökken vagy leáll. A tenyésztésre, amint ez az eddigiekből is kitűnt, a legalkalmasabb a süllyesztett kultúrában, folyékony táptalajon történő fermentáció. A fermentáció hőfoka 25°C és 35°C között változhat, de legelőnyösebb a fermentációt 28°C-on végezni. A keverő fordulatszáma előnyösen 250/perc, a levegőztetés 1/1 v/v. A növekvő tenyészet pH-ja a fermentáció 35— 40. órájában általában a savas pH tartományba (5,5—6,0) tolódik el, majd az antibiotikumtermelés megindulásával párhuzamosan kalciumkarbonát alkalmazása nélkül is a pH 7,5—8,0 értékig emelkedik, és ezen az értéken állandósul. A citotetrin termelése a 80—120. órában éri el a maximális értéket. Mivel a fermentáció ideje a maximális antibiotikum koncentráció elérése még az azonos táptalaj-összetétel és, fermentációs körülmények ellenére is igen eltérő lehet, célszerű a táptalaj antibiotikum-tartalmát biológiai vizsgáló módszerrel, Bacillus subtilis tesztorganizmus felhasználásával ellenőrizni. Ezen módszer menete, mely alkalmas az antibiotikum elkülönítésének, és a végtermékek minőségének ellenőrzésére is, a következő: A meghatározást az általánosan szokásos módon, pH=8-as húsleves — pepton tartalmú, Bacillus subtilis ATCC 6633 törzzsel fertőzött agarlemezen, diffúziós módszerrel, standard görbe felhasználásával végezzük. Standard anyagként egy 1000 E/mg hatékonyságúnak deklarált szilárd citotetrin komplexet alkalmazunk. Valamennyi eredményünket a továbbiakban ehhez a standard anyaghoz viszonyítjuk. A standard citotetrin 50 jug/ml-es oldatának 0,1 ml-je átlagosan 23 mm-es gátlási zónát eredményez. A vizsgálandó mintát (erjesztéses oldat) metanollal 1:3 arányban hígítjuk, majd félórás állás után a további hígításokat 20%-os vizes metanollal vé-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
