157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére

157415 49 50 A kapott reafccióelegyhez 6,5 mól% feleslegben N-tlokanboxi-leucin-anhidridet adunk gyors keverés köziben, 25—30 C° hőmérsékleten. A reakciót 20 percen ét folytatjuk, miközben a pH-t 5 n ikáliumhidröxid oldattal 9—9,5 értéken tart- 5 juk, A deti'okariboxilezést 3,0 pH érték mellett a fentebb leírt módon végezzük. Ezután á pH-t tömény káliumhidroxid oldattal 10,2-re növeljük, majd elemzés céljára 0,1 milliliteres részt . elveszünk; ez a minta leucilHfenilalanil-(C14

)- io -arginint tartalmaz. A tripeptidet N-tiokarboxi-gli'cil-leucil-feniialanil->(C14

)^arginin pepiiddé alakítjuk olyan módon, hogy 8 mól% feleslegben N-tiokarboxi- 15 -gliicin-anhidridet adunk gyors keverés köziben a reákcióelegyhez 15 C°-on. A reakciót 30 percen át folytatjuk, miközben a pH-t 5 n káliumhidroxid oldattal 9,i8 és 10 között tartjük, majd az N-tiokarfboxi-ipeptidet 3-as pH mellett a fen- 20 tebfo leírt módon dekarboxilezzük. A pH-'t vizes tömény káliumhidroxid oldattal 10,2-re növeljük, majd a kívánt terméket tartalmazó 0,1 ml aliquot részt elemzés céljára elkülönítünk. 25 A fentebb összegyűjtött részek mindegyikét papíron kramatograifáljük, 4:1 : 5 arányú butanol-ecetsav-víz rendszert használva. A kromatogramokat papírcsík aktivitásának mérésére szolgáló fejjiel radioaktivitásra vizsgáljuk. 30 Az eredményék azt mutatják, hogy az összes kívánt reakció '8i5%-nál nagyobb kitermeléssel szolgáltat olyan terméket, amely lényegileg nem tartalmaz 'mellékreakció-terimékeket. 35 A reakcióelegyet fagyasztva szárítjuk, és a maradékot háromszar extraháljuk 150 ml térfogatú metanolHfrakeióikkal. Az egyesített frakciókat 40 C°-on vákuumban szárazra pároljuk. 'A maradékot 2 ml vízben felvesszük, és az 40 oldat negyed részét egy literre hígítjuk. Ezt a hígított oldatot kromatografáljuk 200 ml hidrogén-ciklusú fearboxil-típusú ioncserélő gyantaoszlopon (CG—'50 típusú gyanta, beszerezhető Rohm and Haas-tól, Philadelphia; oszlopátimé- 45 rő: 2,2 cm; oszlapmagasság 55 cm). Az oszlopot 2,5 ml/pere sebességgel tápláljuk az oldattal, majd vízzel mossuk, amíg 2 liter mosóvíz nem gyűlt össze. Az oszlop eluálását 0,01 n kénsavoldattal végezzük. A kifolyó oldat C14

izotóp 50 tartalmát antraeén-toszlopot használva ellenőrizzük, amelyet kezdetben 0,2 ml/perc sebességgel táplálunk. A táplálási sebességet fokozatosan növeljük 20 óra alatt 0,6 ml/perc értékre, és a sebességet a kísérlet végéig állandó értéken 55 tartjuk. A kifolyó oldatot 24 ml frakciókban gyűjtjük össze, és a kívánt terméket úgy kapjuk, hogy a !fcí[Vánt izotóp-tartalmat mutató frakciókat egyesítjük, a pH-t 50%-os vizes nát-' riumhidroxid oldattal 9,5-re állítjuk be, és az 60 oldatot fagyasztva szárítjuk. A maradékot metanollal extraháljuk, és az extraktumot 40 C°on vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot kis mennyiségű vízben oldjuk, és a pH-t tömény sósavval 3,5-re állítjuk be. Az oldatot ^ fagyasztva szárítjuk, és így a kívánt terméket kapjuk, amelyet vizes etanoliból átkristályosíturik. 33. példa: Hisztidil^alanil-leucil-glicil-izoleucin előállítása 4 millimól alanil-leucil-glicil-izoleucin 30 ml vizes káliumborát pufiferrel készített keverékéhez 9,5-ös pH-n gyors keverés köziben hozzá-Deák — 17 borg. X. 14. adunk 4,3 millimól N-tiokarboxi^hisztidin-anhidrid-hi'drabro'midot, miközben a hőmérséikle' tét, 15 C°j

on tartjuk. A reakcióelegyet továblbi 20 percen át ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd a hőmérsékletet k'b. 3 C°-r'a csőikkéntjük. A pH-t 3,1-re állítjuk be, hogy elősegítsük a detiokarboxilezést, majd a reakcióelegyet nitrogénnel átöblítjük. A pH-t 7-re állítjuk fee, és a kívánt terméket kromatográfiai úton különítjük el, szilikagél felhasználásával. 34. példa: Glicil-hisztidil-glicil-ifenilalanil-leuícin előállítása 40 millimól leuein 400 ml 0,45 mólos bórsav pufferrel (készített oldatának pH-ját nátriumhidroxíiddal 2 C°-on 110,5-re állítjuk be keverőben, nitrogén^atmoszféra alatt. A kevert oldathoz gyorsan hozzáadunk 35 millimól N-karboxi-fenilalanil-anhedridet, miközben 50%-os nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával a pH-t 10,5-ön tartjuk. A reakcióelegyet szűrjük, és a színtelen szűredéket 50%-os kénsav^oldattal 5,4-es pH-ra savanyítjuk meg, miközben nitrogént buborékoltatunk át az oldaton. A fanil-alanil-leucin termék kicsapódik és szűréssel elkülöníthető. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás amidnkötést tartalmazó vegyületek ellenőrzött szintézisére, azzal jellemezve, hogy legalább egy helyettesíthető hidrogénatomot tartalmazó amino-csoporttal rendelkező kiindulási araino-jvegyületet N-tiiokarboxi^aminosavanhidriddel vagy annak valamilyen származékával reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1966. április 28.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítása módja peptidek és azok származékainak szabályozott, lépésenkénti szintézisére, azzal jellemezve, hogy a kiindulási amino-vegyület aminosav, peptid vagy azok származéka. (Elsőbbsége: 1966. április 28.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja peptidek és azok származékainak szabályozott, lépésenkénti szintézisére, azzal jellemezve, hogy a kiindulási amino-vegyület 25