157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére

157415 35 36 15. példa: Karboxipeptidáz-B felhasználása Ez a példa azt az eljárást illusztrálja, amely­nek segítségével arginint távoli tűrik el egy pep­iidből karboxipeptidáz-B felhasználásával. Három keveréket készítünk az alábbi módon: i(,l) 100 ml trisiz-putffert (0,1 mól anyag nátri­umkloridban és 0,2 mól anyag trihidroximetil­-aminometánbían), 7,65 pH-n; (2) 8,5 mg leucil-alanil-glicil-prolil-feni'lalanil­-arginin-szuilfátot 3,3 ml azonos puff erben; (3) 10 ml enzim-keveréket olyan módon, hogy 0,015 ml olyan karboxipeptidáz-B elegyet, amely 10 mg enzimet tartalmaz ml-enként, ugyanezzel a puíferral hígítunk. A keveréket az alábbi módon elegyítjük: 2 ml (l)-es keverék 1 ml (:2)-es keverék 1 ml (3)^as keverék és 37 C°-on 1 órán át inkubáljuk. Ezután az elegyet szilikagélen vékonyréteg­kíromatografálásnak vetjük alá, és így két fol­tot figyelünk meg. Az egyik argimin, míg a másik a pentapeptid. Amikor ezt a reakciót preparaitív léptékiben folytatjuk le, az oldatokat azonos arányiban elegyítjük, és az inlkubiált elegyet fagyasztva szárítjuk, metanollal extraiháljuk, a metanolos oldatot szárazra töményítjük, a maradékot víz­ben felvesszük, és a terméket IRC 50 gyantán végzett kramatagrafálással különítjük el a vi­zes oldatból. 16. példa: Valiil-alanil-glioíl-prolil-ffenilalanil~(C14 )­-larginin előállítása Ez a példa egy jelzett peptid előállítását il­lusztrálja. umíhidroxid-oldattal 10,2-re növeljük, és a prolü-ÍC^arginmt tartalmazó reakcióelegyíből 0,1 ml-t félreteszünk. A kapott' reákicióelegyhez gyors kevorés köz-5 ban, 0—i2 C° hőmérsékleten 300,5 mg (8,5 smól% felesleg) prolint adunk. A reakciót egy percen át folytatjuk, miközben a pH-t 5 n káliumhidroxid-oldattal 10,2 és 10,1 között tartjuk. A dakarlboxilezést 3,0 pH-értek mel-10 lett a fentebb leírthoz hasonló módon végez­zük. Ezután a pH-t tömény káliumhidroxid­oldattal 10,,2~re növeljük, és elemzés céljára 0,1 ml aliquot részt teszünk félre, almely glicil­-prolil-lfenilalainil(iC14)-iarg:inint tartalmaz. iö A tetrapeptidet úgy alakítjuk át az alanil-glieil-piiolil-fenilalanilH(C14 )^airginin-N^karboxi--peiptiddé, hogy 248 mg (8 mól% felesleg ala­h'in-N-kariboxi-an!hidriidet adunk gyors keverés 20 köziben a reakcióelegylhez, 0—2 C° hőmérsék­leten. A reakciót egy peroen át folytatjuk, mi­közben a pH-t 5 n káliuimihidroxid-oldiattal 10,2 és 10,0 között tartjuk, m,ajid az N4tarboxii-fpep­tidet 3-as pH mellett a fentebb leírt módon 25 defcarboxilezzük. Tömény vizes káliumhidroxid­oldattal a pH-t 10,2-re növeljük, és a kívánt terméket tartalmazó 0,1 ml-t elemzés céljára félreteszünk. 20 Ezután ,340 mg N-karboxivalin-lanihidridet adunk gyors keverés közben a raafccióelegyihez 0—2 C° hőmérsékleten. A reakciót két percen át folytatjuk, miközben a pH-<t 5 n káliuim­hidroxid oldattal 10,3 és 10,0 között tartjuk. 35 Ezután a pH-t tömény kénsavval 6,5-re állít­juk be, és a kívánt radioaktív hexapeptidet tar­talmazó 0,2 ml-t elemzés céljaiból félreteszünk. A fentelbb említett mennyiségek mindegyikét 48 papírkromatografiás eljárással vizsgáljuk, 4:1: : 5 arányú butanol-ecetsay-víz rendszert hasz­nálva. A kromatográmokat radioaktiv mérő­fejjel vizsgáljuk. Az eredmények azt mutatják, Ihogy a kívánt reakciók mindegyike 85%-nál 45 jobb kitermeléssel megy végbe és olyan ter­méket ad, amely melláktenmékekkel gyakorla­tilag nincs szennyezve. Olyan elegyet készítünk, amely 5,0 ml 0,01 50 n sósavoldatlban 0,392 mg egyenletesen jelzett C 14 -arginint 1(0,5 millicurie) és 20 ml 1 mólos káliuimiboriát-ipuífferben ,10,5-ös pH-n 421 mg jelzetlen arginint tartalmaz. 0,2 ml-es részt kü­lönítünk el. A reákicióelegyhez gyors keverés 55 közben, 0—2 C° hőmérsékleten egyetlen rész­letben 401 mg (5 mól% felesleg) fenilajanin-N­-karboxi-aribidridet aduink, és a keverésit 1 peroen át folytatjuk, miközben a pH-t 10,5 és 10,4 között tartjuk 5 n káliumhidroxid-oldat 60 'hozzáadásaival. A reakció végén egy csepp kap­rilalkoholt adunk az elegyhez halbzásgátlóiként. Ezután a pH^t tömény kénsav hozzáadásával 3,5^re csökkentjük, és 10 percen át nitrogént vezetünk át az elegyen. A ipH-t tömény káli- 65 A reakeiióelegyet fagyasztva szárítjuk, a ma­radékot hiároimszar extrahiáljuk 150—150 ml metanollal, és az egyesített frakciókat vákuum­ban 40 C°^on szárazra pároljuk. A (maradékot 2 ml vízzel felvesszük, és az oldat l / /l részét 1 literre hígítjuk. Ezt a hígított oldatot 200 ml • karboxil-típusú ioncserélő gyantáin (CG^SO tí­pus; beszerezhető iRiolhm and Haastól, Philadel­phia) kromatográfiaijuk (az oszlop átmérője 2,2 cm, magassága 55 cm). A felhasznált gyanta hidrogén-ciklusú. Az oszlopra 2,5 ml/perc se­bességgel adagoljuk az oldatot, majd az oszlo­pot két liter víz összegyűjtéséig mossuk. Az oszlopot 0,01 n kénsav oldattal eluáljuk. A ki­folyó oldat C14 izotóp-tartalmiát antraicén-oszlop­pal vizsgáljuk, ahol a kezdeti betáplálása sebes­ség 0,2 ml/perc. A betáplálási sebességet 20 óra 18

Next

/
Thumbnails
Contents