157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére

21 157415 22 ml etilacetátba öntjük. Az egyesített szerves rétegéket .kétszer 30 ml telített nátriumbloridoldattal mossuk, vízimentes nétriumszulfát fölött szárítjuk, szűrjük, majd az oldószert a. szűredékből csökkentett nyomáson lehajtjuk. Az így nyert kívánt terméket úgy tisztítjuk meg, hogy 1Ö0 ml benzollal felvesszük, szűrjük,-és a szűredékihez 150 ml hexánt adva a terméket kicsapjuk, 3. készítmény N-tiokairboxi^enilalanin-anihidrid összesen 5,06- g etiltionouretán-íferailalainint készítünk a 2. készítmény előállításával kapcsolatban megadott módon úgy, hogy a glicint ekvivalens mennyiségű fenilalaninnal helyettesi tjjük, amelyet 25 iml benzollal veszünk fel. A reakeióslagyet kb. 3 C°-ra hűtjük, majd nitrogén-atmoszfférálban cseppenlként kezeljük 0,95 ml foszfortmlbramid 5 mil benzollal készített oldatával. A fosziíartribromid-oldat hozzáadásainak befejezése után a realbciáelegyet további 20 percen át keverjük azonos hőmérsékleten, a kívánt tioarJhidridet tartalmazó zagy kialakulásáig. Ezt a zagyot 50 ml etilacetát és 50 ml víz keverékéhez adjuk. A szerves réteget elkülönítjük és 50 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátmumszulfát fölött szárítjuk, szűrjük, és a szűredéket csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot benzolban felvesszük, és a kívánt terméket ciklohexán hozzáadásával kicsapjuk, majd benzolból és ciklohexáriból végzett átikristályosítással tisztítjuk. 1. példa: Välil-alanil-alaniliprolil-fenilalainil-arginin előállítása 420 mg (2 millimól) anginin-thidroklorid és 5 g jeget tartalmazó 20 ml 1 mólos vizes káliumborát-ípufifer elegyét 1'1-es .ipH-n kb. 0 C°ra hűtjük le, és gyors beverés mellett 386 mg •(2,01 millimól) szilárd N-karboxi-fenilalainin-anlhidridet adunk hozzá. A reákcióelegyet egy percen át keverjük, majd a pH-t tömény kénsavval 0 C°-on 3-ra állítjuk be, miközben kb. 10 peroen át nitrogént buborékoltatunk keresztül. A termékként kapott fenilalanil-argúnint nem különítjük el. Az elegy pH-ját tömény báliumhidroxid-oldat hozzáadásaival 9,5-re állítjuk be, és a rendszer hőmérsékletét 0 C°-ra csökkentjük. 5 g jég hozzáadása után 285 mg (2,02 millimól) N-karfooxi-prolinj

ahedridet adagolunk a reakcióelegyhez, és a rendszert 3 peroen át beverjük. A dekarboxilezést a ifentebb leírt módon végezzük, és a terméket nem 'különítjük el. Az előző eljárást 10-as pH mellett megismételjük olyan módon, hogy 235 mg (2,04 millimól) N-bairboxi-alianin-anhMridet adunk a reakcióelegyhez, és egy percen át keverést végzünk. A. termék alanil^prolil-fenilalanil-arginin, amelyet a fent leírt módon végzett dekarboxilezéssel nyerünk és nem különítünk el. Ugyanezt az eljárást megismételjük 10-es pH 5 mellett, egy peroen át végzett keveiréssel, 235 mg (2 millimól) N-kairboxi-alanin-anhidrid felhasználásával, így alamil-alanil-proriMeniilalanil^arginint kapunk, amelyet nem különítünk - el. 10 Az eljárást 10-es pH mellett megismételjük 294 mg (2,05 millimól) N-karboxi-valin-anhidriddel. Ilyen módon valil-alanil-<alanil-{prolil-fenilalanil-arginint kapunk. A kapott oldat (4-6 ml) ipH-ját vizes nátrium!5 hidroxid-oldattal 7,5-re 'állítjuk be, és 1,0 ml/ /perc sebességgel 1,5 cm belső átmérőjű olyan kolonnára visszük fel, amely 30 ml IRC 50 típusú gyantát tartalmaz saivas ciklusban. A kolonnát 200 ml (vízzel mossuk 2 ml/perc adago-20 lási sebességgel, majd 75 ml 0,25 n kénsavoldattal, ezt követően pedig 75 ml 1,0 n kénsavoldattal eliuáljiulk. Az arginin-tartalimú pepiidet tartalmazó ehiátumút 25 ml-es adagokban gyűjtjük össze 1 ml/perc sebességgel. 25 Az összes frakcióból mintáikat viszünk fel papírkromatogiráfiás vizsgálathoz, szék. butanol/víz/ecötsav (ß/3/il) rendszerben. Kib. 6 cmes oldószér-ífrant mellett a 3-as, 4-es, 5-ös és 30 6-os eluátum-tfrakciók erős ninhidrin-^pozitív sávokat mutattak 0,39-es R/-érték mellett, amely a kívánt hexapeptidre jellemző. (A termék és a reagens R/-tértékeit korábban meghatároztuk vékanyréteg^kromatográfiával.) Eze-35 ket a frakciókat egyesítettük,, vákuumban betöményítettük, a pH-t vizes nátriumhidroxidoldattál 7,5-re állítottuk be, és a konicenitrát'umokat fagyasztva szárítottuk. 40 A fagyasztva szárított szilárd anyagot négyszer 10 ml metanollal extraháljuk, és a metanolt vákuumban eltávolítjuk. A maradékot oldjuk 6 ml vízben, és a pH-t vizes bénsav-oldattal 3,0-ra állítjuk be, majd a terméket ki-45 csapjuk 25 ml metanol és ezt követően 55 ml etanol hozzáadásával. A szuszpenziót éjjelen át hűtjük, majd szűrjük. így a kívánt terméket kapjuk, amit hidrolízis után végzett Spincoféle aminosav-elemzéssel határoztunk meg. 50 Felsorolunk olyan aminosavakat, amelyeket a találmány szerinti eljárásiban felhasználhatunk mind sav-alakban, mind pedig iNnbarboxi-anhidridebként különböző polipeptid-ek előállítá-55 sara. Az összes aminosavnak van rövidítése, és az alább következő felsorolásban a találmány szerinti eljárással előállított termékeket e rövidítések felhasználásával azonosítjuk. A második felsorolásban a GLY-ALA-LEU-ILEU-60 -VAL-FHE jelölésű termék glicil-alanil-leucil-izoleucil^valil-fenil-alanin. Hasonlóan a később ismertetlésre kerülő termékékhez, ezt is a fentebb illusztrált eljárással állítjuk elő. Az optimális körülményeket a reagensek boncentrá-65 ciója, a pH, a hőmérséklet és "a reakcióidő teli