157367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gibberellinsav biztonságos termelésére

7 157367 8 agar-blokkofc teljes beszáradásia után felszálló kromatográfiait végeztük 15 órán keresztül n-butanol-1,5 m NH4OH (3 : 1) rendszemrel. Szá. rítás és etanolkénsavas előhívás Után a gihberellinsavat fluoreszcenoiás úton mértük. A vizsgálatoknál a táptalaj rétegvastagságának szórásiát fiigyeleimfoevéve 0,07 ml blokktérfogatbal számolhiatunlk. Ebből a mennyiségből a fent ismertetett módon 1 y gibberellinisav jól azonosítható. Ez a módszer szilérd táptalajban a törzsek . fiziológiai vizsgálat aimak gyors elvégzésére is alkalmas, így pl. különböző összetételű táptalajok, prefcurzorok, hőmérsékleti hatások, pH-válltozások, puffer-rendszetnelk, valamint különböző fejlődési állapotok vizsgálatára. A módszer finomítható úgy, hogy az agair-jblokkolkból ötszörös térfogatú acetonnal kioldjuk a gibberelliinsavát és szükség szerint hígítás után ebből cseppentünk fél a vizsgálathoz. Ebben a lépésiben elválasztottuk a gibberellinsavat ttarmelő és nem termelő variánsokat. A legaktívabb törzseket tíovábbvititüík u. v. kezelésire. Az u.v. besugárzást 1,5—2 mm rétegvastagságú konidium szuszpenzióval végeztük, a fotoreaktíváció kizárása mellett (Quarzlampen Ges-ellßeihaifit mbH Hanau cég Sterisol P. L. 130 típusú készüléke), alkalmazott dózis 60 erg/' mm2/sec. sr. Ezután a törzset az alábbi inódon letiiléniminnel kezeltük. 3,5 • 10° csíra/ml élőcsíra számú konidium szuszpenzióban 1 :100 etilénimíin koncentrációt alítottunk be. A szuszpenzió metilvörös-metnkék keverékindiikátort tartalmaz. 1 perces kezelés után az etiilénimin hatását 1,5 n HCl oldattal leállítottuk, a végpontot az indikátor áticsapása (ibolya) jelezte. így akroimogén konidiumot nem képző mutánst (Fusarium monoliforme G—-13 állítottuk elő, amelyet minthogy csak vegetatív úton szaporodik, Fusarium monillforme var. sterile névvel láttuk el. A túlélőket a fenti táptalaj agar nélküli változatán tenyésztettük. Az oltáshoz felihasznált inokulum kora 110 óra, mennyisége 1,7% és a betáplált levegő mennyisége 1,0 liter/liter táptalaj volt. A tenyészetet 28 C°-on inkubáltuk. A kapott eredményeket az í. táblázat mutatja. kubáció Gibberellinsav pH (óra) (y/ml) 24 . 5 48 — 4,5 72 100 3,5 96 140 3,5 120 250 3,5 144 510 3,5 168 800 3,5 192 960 4,0 A tenyésztés befejezése után a fermentlé pH-ját 10 %-os sósav-oldattal 3—4-re állítottuk be, majd szűrtük. A micéliumot a fermentlé menynyiségének megfelelően 8 %-nyi csapvízzel mostuk, a mosóvizet és szűrt levet egyesítetük, majd 10 g/liter aktív szenet adtunk hozzá és félórán át kevertük. -Ezután a szenet leszűrtük és 20—30% nedvességtartalom eléréséig szárítottuk. A szénről a hatóanyagot a következőképpen oldottuk le. Félórán át 40 C°-on 5—6-szoros mennyiségű acetonnal kevertük, majd a szenet leszűrtük. A leoldást háromszor megismételtük, majd az eluátumot 40 C°-on bepároltuk, amíg csak vizes oldat maradt vissza. Ezt a vizes oldatot kétszer • egyenlő térfogatú etilacetáttal extraháltuk. Ezután az etilacetátos fázisokat egyesítettük és kétszer 25 tf% 6,2 pH-ju foszfát-pufferoídattal extraháltuk. A pufieres extraktumokat egyesítettük, majd a pH-t 10 %-os sósavoldattal 3,8-ra állítottuk és kétszer egyenlő térfogatú etilacetáttal ismét extraháljuk. Az etilacetátos fázisokat egyesítettük és vákuumban 60 C°-on bepároltuk, amíg a kristályok megjelentek. Az első kristályok KHaPCv.-kristályok voltak, amelyekről az etilacetátot leöntöttük és a bepárlást kristályosító csészében vízfürdőben addig folytattuk, amíg a gibberellinsav kikristályosodott. A kristályokat kevés etilacetáttal mostuk, majd 100 C°-on megszárítottuk. Kitermelés 75 %, olvadáspont 232—234 C° (gázfejlődés). Az anyalúgot a fenti módon újra feldolgoztuk, 2. példa A Fusarium moniliforme törzset az 1. példa szerinti módon neutron-, röntgen- és u.v. kezelésnek vetettük alá. Ezután a túlélőkből veronál-nátriumacetát pufferben (pH 8,6) mikrokonidium-szuszpenziót készítettünk. Lemezöntéses eljárással meghatározzuk a szuszpenzió élő csíraszámát (1,6 10° csíra/ml). 10 ml konidiumszuszpenzióban 80 mól/ml etilmetánszuifonát koncentrációt állítottunk be. Az így kezelt szuszpenziót 9 órán át 28 C°-on inkubáltuk. 100.000-szeres hígítás után kukoricaliszt-malátakivonat-agar táptalajra terítettük a kezelt anyagot. 9 napon át tartó 28 C°-on végzett inkubáció után a túlélő telepeket megvizsgáltuk gibberellinsav termelésre. A gibberellinsav termelés szempontjából pozitív törzseket szubmerz tenyészetben is ellenőriztük kukoricaliszt-malátakivonat folyékony táptalajon. A kezelés során kapott, legtöbb GS-t termelő törzset használtuk fermentációra. Kitermelés: 72 %. 3. példa A 2. példa szerinti módon neutron-, röntgen-, u.v. besugárzással, majd etilmetánszulfonáttal végzett kezelései kapott törzs malátakivonatkukoricali^zt-agar tenyészetéből mikrokonidium szuszpen^.ót készítettünk. Lemezöntéses eljárással meghatározzuk a szuszpenzió élő-csíra-10 15 20 25 £0 35 40 45 50 55 60 4