157076. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ACTH-hatású peptidek előállítására
157076 10 9. BOC—D—Ser—Tyr—Ser—Nie—Glu —(OtBu)—His—Phe—Arg—Try—Gly—Lys— —(BOC)—Pro—Val—Gly—Lys—(BOC)—Lys (BOC)—Lys(BOC)—Lys(BOC)—NH2 1 g BOC—D—Ser—Tyr—Ser—Nie—Glu(Ot-Bu)— His—Phe—Arg—Try—Gly—OH-t és 0,7 g H—Lys(BOC)—Pro—Val—Gly—Lys(BOC)— —Lys(BOC)—Lys(BOC)—Lys(BOC)—NH2 -t (ld. 154 657 sz. magyar szabadalmi leírás) 20 ml piridinben és 0,83 ml n sósavban szuszpendálunk, és 15 percen át 5.0 C°-on keverjük. Ezután hozzáadunk 0,4 g diciklohexilkarbodiimidet és további 3 órán át 50 C°-on keverjük. Ezt követően még egyszer azonos mennyiségű karbodiimidet adagolunk és 3 órán keresztül újra 50 C°-on keverjük. A piridin fő tömegét vákuumban eltávolítjuk, a maradékot 30 ml meleg dimetilformamiddal elegyítjük, szétdörzsöljük és a szennyeződésektől megszűrjük. A szürletet nagy vákuumban 40 C°-on kb. 5 ml térfogatra bepároljuk és nagy mennyiségű vízzel összekeverjük. A kivált nyersterméket jól eldörzsöljük, leszívatjuk, vízzel mossuk és szárítjuk. További tisztítás céljából a terméket dimetilformamid-ecetészterből lecsapjuk, majd ellenáramú megosztásnak vetjük alá metanol-puffer-kloroform-széntetraklorid (10:3:7:4) oldószerrendszerben (puffer: 28,5 ml jégecet és 19,3 g ammóniumacetát 960 ml vízben). 120 megosztólépés után a 38—-54. csövekből tiszta, védett oktadekapeptid-amid-származékot kapunk (súlymaximum a 44-es csőben, megoszlási szám K = 0,58). A termék szilikagél lemezeken készített vékonyrétegkromatogrammon az alábbi R/-értékeket mutatja: R/ kloroform^metanol (75:25) rendszerben 0,22 mennyiségű, peroxidmentes éter hozzáadásával . lecsapjuk. A hidroszkópos terméket leszívatjuk, éterrel mossuk és szárítjuk. Acetáttá való átalakítás céljából 1%-os ecetsavban feloldjuk, 5 acetát-alakú, gyengén bázisos ioncserélőoszlopon (Merck No. II) szűrjük és 1%-os ecetsavban utánamossuk. Az eluátumot n-oktanol hozzáadásával 40 C°-on vákuumban bepárojuk, a maradékot, az oktanol eltávolítására petroléterrel 10 mossuk és szárítjuk. Ezután a terméket kevés vízben feloldjuk és liofilizáljuk. A D-Ser'-Nle4 Lys17 > 18 -/? W8 -kortikotropin-Lys 19 -amid oktadekapeptidamid acetátját száraz, csaknem fehér por alakjában kapjuk. Az oktadekapeptidamid 15 papírelektroforézis esetén 6,3-as pH-nál 10 cmes futtatási hosszat mutat (katóddal szemben) (Papír: Schleicher & Schüll 2043/b mgl-es, piridin-acetát puffer, 1 óra, 200 V). Az alumíniumoxid lemezeken készített vékonyrétegkroma-20 togramm az alábbi R/-értékeket mutatja: R/ (52 A) = 0,18 Rf (101) = 0,25 25 2. példa Oldatampullát készítünk az alábbi komponen-30 sekből: D-Ser^Nleí-Lys^^i-iS-kortikotropin-Lys18 -amidacetát " 0,5 mg Zselatin - 280,0 mg 35 Fenol 5,0 mg Desztillált víz ad 1,0 ml R; (43 A) 0,46 40 A kiindulási anyagként alkalmazott védett oktapeptidamidot, a H—Lys(BOC)—Pro—Val— —Gly—Lys(BOC)—Lys(BOC)—Lys(BOC)—Lys (BOC)—NH2 -t úgy állítjuk elő, hogy Z—Lys (BOC)—OH-t H—Lys(BOC)—OH-val konden- 45 zálunk diciklohexilkarbodiimid jelenlétében, a védett dipeptidésztert ammóniagázzal metanolban amiddá alakítjuk, a karbobenzoxicsoportot palládiumos szén jelenlétében hidrogénnel lehasítjuk és az így kapott H—Lys(BOC)—Lys 50 (BOC)—NH2-t az azid-módszer segítségével az 1 214 242 sz. német szabadalmi leírásban ismertetett Z—Lys(BOC)—Pro—Val—Gly—Lys (BOC)—Lys(BOC)—NH—NH2 -vel kondenzáljuk. 55 10. H—D—Ser—Tyr—Ser—Nie—Glu—His— Phe—Arg—Try—Gly—Lys—Pro—Val—Gly— —Lys—Lys—Lys—Lys—NH2 Az ellenáramú megosztással tisztított, védett 60 oktadekapeptidamid 0,5 g-ját 1£ ml jéghideg 90%-os trifluorecetsavban oldjuk és az oldatot 1 órán át 25 C°-on állni hagyjuk. Ezután vákuumban kis térfogatra bepároljuk és a szabad oktadekapeptidamid trifluorecetsavas sóját nagy 65 3. példa D-SerLNle^-Lys^^-i-^-kortikotropin-Lys18- amidacetát sterilen szűrt vizes oldatát aszeptikus körülmények között nátrium-polifloretinfoszfáttal és nátriumkloriddal összekeverjük, ampullákba töltjük és liofilizáljuk; így száraz ampullákat kapunk, amelyek az alábbi komponenseket tartalmazzák: D-Ser^Nle4 -Lys17 > 18 -i#-1-18 -kortikotropin-Lys 18 amidacetát • 0,5 mg Nátriumpolifloretinfoszfát (86,5%-os) 23,20 mg NaCl 12,28 mg Használat előtt a száraz ampullák tartalmát oldószerampullában levő 2 ml desztillált vízzel keverjük össze. 4. példa 0,7 ml desztillált vízben 11,12 mg jégecetet, 1,21 mg nátriumacetátot, 2,5 mg nátriumkloridot és 2,0 mg D-Serí-Nleí-Lys^'^-zS-i-^-kortikotropin-Lys18 -amidacetátot oldunk és desztillált vízzel 1 ml-re feltöltjük. Az oldatot 120 C-on 20 percen át autoklávban sterilizáljuk. A pH a sterilizálás után 3,7. 5
