156901. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyengített rubella-vírus előállítására

156901 keembrióból álló szövettenyészetre olymódon végezhető el, hogy klinikai anyagot vagy előzetesen tetszés szerinti szövettenyészeten, így főleg majomvesét, vagy embriót tartalmazó kacsatojáson szaporított vírust izolálunk. A beoltott tenyészeteket 30—34 C°-on (optimálisan 32 C°), vagy 35—38 C°-on (optimálisan 36 C°) inkubáljuk. Az izolálási műveletek pl. á következők lehetnek : A) 1. A rubella vírust grivet-majomvese szövettenyészetré izoláljuk, majd sorozatszakaszokban embriót tartalmazó tyúktojásokon, grivetmajomvese szövettenyészeten, kacsaembriót tartalmazó szövettenyészeten és csirkeembrió szövettenyészeten vezetjük keresztül. A) 2. A rubella vírust grivet-majomvese szövettenyészetre izoláljuk, majd a sorozatszakaszokban grivet-majomvese szövettenyészeten és csiirkeembrió-szövettenyészeten vezetjük keresztül. A) 3. A rubella vírust klinikai anyagból grivet-imajomvese szövettenyészetre izoláljuk, majd az izolált vírust sorozatszakaszokban kacsaembrió szövettenyészeten és csiitkeembrió-szövettenyészeten és csirkeembrió-HSZövettenyészeten vezetjük keresztül. A) 4. A rubellla vírust kacsaembrió-szövettenyészetre izoláljuk klinikai anyagból, majd sorozatszakaszokban az izolált vírust kacsaembriószöviettenyészeten és csirkeembrió-szövettenyészeten vezetjük keresztül. B) A gyengített élő rubella vírus-vakcina tenyésztése. Az A. műveleti részben rubella vírusként izolált anyagot csirkeembrió-szövettenyészetet tartalmazó üvegpalackokba adagoljuk. A csirkeembrió-szövettenyészetet kb. 10 napos csirkeembrió felvagdalásával és tripszinnel való kezelésével készítjük. A szövettenyészet közege a sejttenyésztésben használt tetszés szerinti közeg lehet, így pl. a 199-es számmal jelölt ismert közeget használjuk, amelyhez borjúszérumot adagolunk. A megfelelő szintetikus tenyészközeg pl. a 960.642 sz. angol szabadalmi leírásban ismertetett „Eagle's Basael Medium," továbbá a 960.850 sz. angol szabadalmi leírásból ismert „SN 199" közeg lehet. Ilyen tenyészközeg az 1 000 907 sz. angol szabadalmi leírásban is ismertetve van. A vírus hozzáadása után a fertőzött szövettenyészetet több egymást követő' szakaszban 30—38 C°, célszerűen 30—34 C° (optimálisan 32 C°) és 35—38 C° (optimálisan 36 C°) közötti hőmérsékleti értékeken inkubáljuk. Az inkubálást stacioner, görgetett vagy rázott kultúrában különböző időtartamokig végezzük, eközben a vírus nagy mennyiségben szaporodik és egyben gyengítette válik. Az előbb említett sorozatos tenyésztési szakaszokat úgy állítjuk össze, hogy hígítatlan vagy hígított oltóanyagot használunk és különböző időszakokban a felszaporodott tenyészetet összegyűjtjük. A titrálást grivet-majomvese szövettenyészeten végezzük. Megfelelő időközökben a tenyészeteket megközelítően 1000 TDID50 egységnyi vírusgyengítő tulajdonságokkal rendelkező más vírussal (Bunyamwera stb.) kezeljük. A kémcsöves tenyészeteknél az ellenvírus távolléte esetén sejtkórtani úton megállapítva 3—4 napos 5 utókezelési szakaszt végzünk az ellenvírussal és ezeket a tenyészeteket is rubella vírussal fertőzöttnek tekintjük. Ezután a vírustenyészetet összegyűjtjük és a fagyasztott állapotban vagy más alacsony hőmérsékleten tároljuk arra ügyel-10 ve, hogy a szer fertőző jellegét megőrizzük. C) Az ismételt sorozatos tenyésztési szakaszokból összegyűjtött rubella vírust megfelelő stabilizálószer, mint szaccharóz, emberi albumin 15 glutamin, foszfát vagy ezek keverékének hozzáadásával stabilizáljuk. A vírus hatékonysági titerének megállapítása után az összegyűjtött vírust több részre osztjuk és felhasználás céljaira ampullákba letöltjük. Az előállított termék tá-2Q rolható és fagyasztott állapotban adagolható, vagy a teriméket liofilizáló szárítás után a nedvesség kizárása mellett száraz állapotban adagoljuk. Ha az elkészített vakcina majmok és rágcsálók esetében nem bizonyult patogénnek, ak„_ kor embergyógyászati kísérleteket is végezhetünk, hogy a szer immunitási tulajdonságait meghatározzuk. A találmány szerinti eljárás további részleteit az alábbi kiviteli példák szemléltetik. 30 35 40 1. példa: A kezdeti oltóanyagot az A)l. művelettel nyerjük. 9—11 napos csirkeembriókat lefejezünk és a végtagokat eltávolítjuk, majd az embriót aszeptikus körülmények között finomra vagdaljuk és a felvagdalt szövetet több részletben Hanks' BSS-el mossuk. A mosott szövetet 36 C°-on 0,25%-os tripszin (Difco 1:250) trisz-^sós pufferes oldatával 2—3 óra hosszat kezeljük. A tripszinnel kezelt sejtszuszpenziót kettős vastagságban alkalmazott steril kötőgézen összegyűjtjük és 1500 fordulatszám mellett .5 percig centrifugáljuk. A tamponált sejteket megszámlálás cél-45 jából a tenyészközegben ismét szuszpendáljuk. A tenyészközeg 199-es számú közegből (Morgan, J. F., Morton, H. J. és Parker, R. C, Proc. Soc. Exp. Biol, and Med., 73:1—8, 1950) áll, amely 2% agammá borjúszérumot (amelyet 30 percig 50 56 C°-on melegítünk) és 50 mcg/ml Neomycint tartalmaz. A palacktenyészetet úgy állítjuk be, hogy ml-ként 350 000 osíraképes sejtet tartalmazzon. Ezután a tenyészetet 36 C°-on 48—96 óra hosszat inkubáljuk és a palacktenyészeteket 55 felhasználhatjuk a sorozatos tenyésztési szakaszokban vagy a vakcina készítése során. A csirkeembrió szövettenyészetet üvegpalackokban állítjuk elő, amelyek tenyésztési közegként 199-es számú közeget és 2% inaktivált bor-60 júszérumot tartalmazzon. 3—4 nap utótenyésztés után a közegben levő tenyészetet aszeptikus körülmények között leszivatjuk, vagy leöntjük és a palack-tenyészeteket 100—100 ml Hanks' B.S.S. annyaggal négyszer mossuk, majd palac-65 konként 2—3 ml fent említett oltócsíraként 2