156574. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a G-252 antibiotikum előállítására és kinyerésére
156574 11 útján került sor. A mérést az alábbi módon öszszeállított oldattal végeztük el: 12 metilénkék etilalkohol 1,0 g 100,0 ml Az oldatot 2 napig gyakran felrázzuk, megszűrjük, majd desztillált vízzel 5000 ml-re egészítjük ki. A mérés úgy történt, hogy normál kémcsőbe 1 ml mérőoldatthoz 5 ml ífermentlevet mértünk, majd a kémcsövet egyszer megfordítva tartalmát összekevertük. Stopperóra segítségével leolvastuk, hogy az anyagban a metilénkék — leükoimetilénkék reakcióhoz mennyi idő szükséges. A tenyésztés során tapasztalt 2 metilénkékredukciós időminimum (azaz 2 dehidrogenáz-enzimaktivitás-maximum) közül a tenyészetet a második metilénkék-redufeciós idő minimumnak megfelelő állapotban oltották át; ez a tenyészet 46 órás korában következett be, amikor annak pH-ja 7,2 értéket mutatott. 400 liter előfermentációt 6000 liter űrtartalmú f érmen torban 60 percen át ,1.0 atü-n sterilizált, majd léhűtött 4000 liter alábbi összetételű tápfolyadéklba oltottunk: 10 15 20 szójaliszt szorbit kukoricalekvár CaGO,, NaCl 2,0 % 2,0 % 0,25% 0,2 % 0,4 % pH sterilizálás előtt 6,8, sterilizálás után 7—7,2. A tenyészetet 28 C° tartása mellett 4000 liter/ min. mennyiségű steril sűrített levegővel levegőztetjük. Habgátlóként napraforgóolajat alkalmaztunk. A levegőztetés és kevertetés megfelelő hatásfokát 6 kW energiát felhasználó keverő segítségével biztosítottuk. Az alkalmazott táptalajon a fermentlé pH-ja kezdetben emelkedett, 7,l ,8-nál tetőzött, majd 7,'0-re visszaesett. Ekkor a fermentlé térfogatára számítva újabb 1% szór bitót adagoltunk a rendszerhez, ami a fermentáció végéig ((120 órás kor) a pH értékét 6^5-ig csökkentette. A fermentáció végén a hatóanyag-tartaiom biológiai módszerrel mérve 2,370 /xg/ml volt, standardként 385 nm-nél E i% = 80S terméket alkalmazva. 3. példa: 3 m3 G—252 előző példa szerint nyert fermentlevet oxálsawal pH = 3,5-re savanyítottuk, majd micéliumát keretes szűrőprésen kiszűrtük. Ily módon 650 kg szűrőprésnedves micéliumot nyertünk. Ezt 2 m3 -es keverős extráktorban 1048 liter n-butanollal és 226 liter piridmnel elszuszpendáltuk, majd 62 liter víz adagolásával az elegy víztartalmát 15%-ra állítottuk be. A szuszpenziót ezt követően további 1 órán át kevertettük. A szuszpenzióból az extraktumot szűrőcentrifugán elkülönítettük, majd vákuumban 36 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten 500 literre pároltuk be. A részlegesen bepárolt sűrítményt 25 liter vízzel kevertük ki, majd 2 órai ülepítés után az elvált erősen színezett, vizes fázist leengedtük és elönttöttük. A visszamaradt organikus fázist ezt követően vákuumban tovább pároltuk 20*0 liter végtérfogatra. Az így nyert sűrítményt 12 óra hosszat 0 [-5 C° hőmérsékleten tartottuk. Az ekkor kivált G—252 szabad savat szűrőcentrifugán kinyertük, majd 1 x 30 liter száraz butanollal és 2 x i30 liter száraz acetonnal felszuszpendáltuk és ismételten centrifugáltuk. Ily módon 2452 g G—352 szabad savat nyertünk ki, sárga amorf por formájában. Kitermelés: a fermentleben biológiailag elemzett hatóanyagtartalomra: 34,4%. 4. példa: Az előző példa szerint nyert G—25,2 szabad 25 sav 100 g-os részletét lisztfinomságúra való elporítás után 2,7 liter abszolút metanolban szuszpendáltunk, majd 95 ml 2,5% fém-nátrium oldásával készült nátriummetilá t-oldatot csepegtettünk hozzá, 1 óra leforgása alatt. A szusz-30 penzió p,H-ját a belőle kivett és vízzel 1 :2 arányban meglhígított kis részlet pH értéke alapján ellenőriztük. A nátriummetilát adagolását — a pH-t az előbbiek szerint mérve — 9-es pH eléréséig folytattuk. A kevés oldatlan 35 maradéktól az oldat tisztáját eentrif ugatással elválasztottuk. A metilalkolholos oldat tisztáját (2,1 liter) 5,7 liter butanollal és 6 liter vízzel elegyítve homogén oldatot kaptunk. Ezt az oldatot 20 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten, 40 vákuumban, kezdődő habzásig desztilláltuk. A habzás 750 ml maradék térfogatnál következett be. Az így nyert enyhén opálos és csak vizes G—252 nátriumsót tartalmazó oldatot 5 g aktívszénnel derítettük 'és steril szűrőlapon élesre 45 szűrtük. Alkalmasan választott edényben 14 liter száraz normál butanolt rétegeztünk fölé. Az edényt 1440 fordulat/perc sebességű, hatásos propeller keverővel szereltük fel. A G—252 nátriumsó vizes oldatot a butanolban a keverő 50 megindításával szuszpendáltuk. A szuszpenzió kevertetését további fél órán át folytattuk, majd 12 órán át 0 C° hőmérsékleten tartottuk. A kivált szilárd G—252 nátriumsót szűrtük, kevés butanollal és acetonnal mostuk. Ily módon 55 finom por alakjában 71,4 g G—252 nátriumsót nyertünk. 5. példa: 60 Az előző példa szerint nyert G—252 nátriumsó 50 g-os részletét 100 ml desztillált vízben oldjuk és 23 cm 0 60 cm magas, 25 liter nedves térfogatú Sephadex G—-25 márkájú dextrángél-oszlopon vezetjük át, 5 liter/óra áram-6s lási sebességgel. 13,5 liter térfogat után szem-6
