156235. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
15 156235 18 a bepárlási maradékból pedig 60 ml petrolóter hozzáadásával a pepiidet kicsapjuk. A ki-, csapott terméket 50°-on nagyvákuumban szárítjuk. A levegőnedvességre való beállítás után kapott termék súlya 5,21 g; a termék amorf, vékonyrétegű kromatografálás során egységesnek bizonyult. A termék titrálással és elemi analízissel megállapított összetétele azt mutatja, hogy 1 mól oktapeptidamidra 0,63 mól ecetsavat és 13 mól vizet tartalmaz. A szilikagélen végzett vékonyrétegű kromatografálás során a következő R/-értékek adódnak: R/ (9 : 1) kloroform-metanol = 0,08 R/ (100) = 0,46 9. Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys (BÖC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys (BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 3,91 g Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NHNH2 -ot (vö. 1214 242. sz. német szabadalmi leírás) gyenge melegítés köziben 40 ml vízmentes diimetilformamidban feloldunk, az oldatot —20°-ra lehűtjük és ezen a hőmérsékleten keverés közben sorrendiben a következő anyagokat adjuk hozzá: 6,58 ml 2,15 n sósav és 0,74 ml 5 n nátrium-nitritoldat. A beadagolás után még 15 percig —10°-on a reakcióelegyet keverésben tartjuk, majd 4,07 g H-Lys(BOC)-Lys(BGC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 11 ml dimetilformamidban képzett és előrehűtött oldatát valamint 1,98 ml trietilamint adunk hozzá. A beadott peptid 2,5 % ecetsavat és 15,3% vizet tartalmaz. A kapott keveréket 1 óra hosszat 0°-on keverésiben tartjuk, majd trietilamin hozzáadásával 7,5 pH^értékre állítjuk be. Végül éjjelen keresztül 0°-on állni hagyjuk. Állás után a reakciókeveréket nagyvákuumban kb. 20 ml térfogatra bepároljuk és 100 ml vízzel felhígítjuk. Vízzel való' hígításra a bepárlási maradékból a nyerstermék válik ki, gélszerű alakban. A csapadókot leszűrjük, vízzel mossuk, végül háromszor metanol-víz-elegyből, kétszer pedig metanol-lbenzol-petroléter-elegyből átoldjuk. Az előtisztított 4,72 g anyagot 12:4:9:3 arányú metanol^puffer-kloroform-széntetrakloridból álló oldószer-rendszerben (a puffer összetétele: 28,5 ml jégecet + 19,25 g aimmóniumacetát 960 ml vízben) Craig-lszerint 160 fokozatban multiplikatív megosztásinak vetjük alá és mindenkor 20—20 ml fázistérfogatot alkalmazunk. A 45—74 megosztási elemekből (rmax = 57; K = = 0,55) nyert anyagot szárazra pároljuk és az ammóniumacetátot 45°-on nagyvákuumban elszublimáljuk, így összesen 3,3 g kromatográfiai szempontból egységes védett tetradekapeptidet nyerünk, fehér, amorf por alakjában, amelynek bomláspontja kb. 210°. Vékonyrétegű kromatografálás során szilikagélen az alábbi R/-értékek mutalkoznak: R/ (9 : 1) kloroform-metanol = 0,14 R/ (43A) =0,62 R/ (100) = 0,87 10. H • Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC}-Lys(BQC)-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-NH2 5 4,97 g védett tetradekapeptidamidot melegítés köziben 100 ml metanolban feloldunk, majd 1 g 10%-os palládiuimos aktívszén hozzáadása után szobahőmérsékleten és légköri nyomáson a képződő széndioxid abszorpciója közben te-10 lítésig hidrogénezünk. A hidrogénezés után a katalizátort leszűrjük, a szűrletet kb. 15 ml térfogatra bepároljuk és a maradékból 50 ml benzol és 150 ml petroléter hozzáadásával a hidrogénezett tetradekapaptidet kicsapjuk, le-15 szűrjük és nagyvákuumban 45 C°-on szárítjuk. Így 4,25 g amorf pór alakú terméket kapunk, amelynek szilikagélen végzett vákonyrétegű kromatografálása során a következő R/-értékei vannak: 20 R/ (43 A) =0,18 R/ (52) =0,41 R/ (100) = 0,33 25 A termék a kromatografálás alapján egységesnek bizonyult. 11. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys<BOC)-Pro-Val-Gly-30 -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 355 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe^Arg-Tyr-Gly-OH és 400 mg H-Lys 25 (BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro~NH2 -ot 3,7 ml piridin és 0,273 ml 1 n sósav elegyében melegítés közben 50 C°-ig terjedő hőmérsékleten homogenizálunk. A kása-40 szerű, géljellegű -masszához ezután 131 mg dieiklohexil-karbodiimid, 0,2 ml piridiniben készített oldatát adjuk, az elegyet nitrogéngázzal átablítjük, mégegyszer jól homogenizáljuk, majd 3 óra hosszat 50 C°-on állni hagyjuk. 45 Ezután második adagban 131 mg diciklohexil-karbodiimid 0,2 ml piridinben készített oldatát adjuk hozzá, az elegyet ismét nitrogénnel átöblítjük, homogenizáljuk és további 3 óra hosszat 50 C°-on nagyvákuumban szárítjuk. 50 A dicikldhexilkarbamid és más lipofil szenynyezések eltávolítására a nyers terméket kétszer egymásután forró metanolban szuszpendáljuk, benzol és petrolétíer hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük és megszárítjuk. Az előtiszss tított terméket 10 : 3 : 6 : 4 arányú metanol-puffer-kloroform-nszéntetraklorid oldószerrendszeriben (puffer = 28,5 ml jégecet, + 19,25 g ammóniurnaeetát 960 ml víziben) 185 fokozatban multiplifcatív megosztásnak vetjük alá, 60 amelynél mindenkor 10—-10 ml fázistérfogatot alkalmazunk. A 67—86 megosztási elemekből (i*max = 77; K = 0,71) szárazra való bepárlás és az ammóniumacetát 45 C°-on nagyvákuumban történő elszublimálása után tiszta, védett 65 tetrakozapeptidamidot kapunk, fehér, amorf 8
