156235. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ACTH-hatású peptidek előállítására
11 adunk hozzá, homogenizáljuk és a géles-pehelyszerű csapadékot leszűrjük. A szűrt terméket megszárítjuk, 100 ml dimetilformamidban 70"on feloldjuk, amikoris a képződött diciklohexilkarbamid túlnyomórésziben oldhatatlan marad és kiszűrhető. A szűrletből 600 ml benzol és 400 ml petroléter hozzáadásával a kondenzált nyersterméket kicsapjuk, leszűrjük, és szárítjuk. (A kapott termék súlya 4,65 g.) 1,0 g nyersterméket tisztítás céljára metanol-2n ecetsav-klorofornnszéntetraklorid (10 : 3 : 7 : 5) oldószerékből álló mindenkor 75—75 ml felső és alsó fázisból összetett rendszerben gyenge melegítés közben feloldunk és Craig szerint 135 fokozatban mindenkor 25—25 ml fázistérfogattal multiplikatív megosztásnak vetünk alá. A 88—110 megosztási elemekből (rmax = 100; K = 2,8) szárazra való bepárlás és az asmmóniumacetátnak 45 C°-on való nagyvákuumban való elszublimálása útján összesen 490 mg tiszta, védett ofctadekapeptidamid^aoetátot nyerünk, fehér, amorf por alakjában. A kovasavgéllel végzett vékonyrétegű kromatografálás során a termék a következő R/ értéket mutatja: R/ (53) =0,55 R/ (96) =0,68 R/ (100) = 0,45 3. példa: H-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val~Lys-Val-Tyr-Pro-NH2 (D-Seri-Gly 3 -Lysl7 ' l8 -/? 1-24 -korti ; kotropin-Pro 24 Jamid). 293 mg védett tetraikozapeptid-aimidot 14 ml 90%-os trifluoreoetsaviban feloldunk és 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyunk. Az elegyet forgó bepárlóban 30° fürdőhőmérsékleten kb. 3 ml térfogatra bepároljuk, 15 ml vizet adunk a maradókhoz, majd mégegyszer bepároljuk, végül liofilizáljuk. Ekkor a szabad tetrakozapeptid trifluoraoetátját kapjuk, amelyet acetát formába való átalakítás céljára kb. 4 ml vízben feloldunk és 12 mm átmérőjű, 22 cm hosszúságú gyengén bázisos, acetátformájú ioncserélővel (pl. Merk. No. II) töltött oszlopon szűrjük. Az eluáiumot kb. 5 ml térfogatra bepároljuk, liofilizáljuk, 40°-on nagyvákuumban utólagos szárítást végzünk, .majd a termék nedvességtartalmát légszárazra beállítjuk. Ily módon fehér, amorf, vízben jól oldódó por alakjában 279 mg D-Seri-GlyS-Lys^iS-^-^-ikortikotropin-Pro24-amidiacetátot kapunk, amelynek 180°-on nem éles bomláspontja van. A termék alumíniumoxid (DA) és cellulóz (DC) segítségével történő vékonyrétegű kromatografálás során a következő R/-értékek mutatkoznak: DA: R/ (52A) =0,27 R/ (101) =0,66 DC: R/ (101 E) = 0,36 R/ (112 E) = 0,15 12 A kiindulóanyagíként használt tetrakozapeptid származékot az alábbi módszerrel készítjük: 1. Z-Val-Tyr-Pro-NH2 5 18,8 g Z-Val-Tyr-Pro-OtBu-t 95 ml 90%-os trifluorecetsaviban feloldunk és 1 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldatot szárazra bepároljuk és az olajos maradékot 10 100 ml víz hozzáadásával és 0°-on végzett eldörzsöléssel porrá átalakítjuk. Szűrés után súlyállandóságig káliumhidroxid felett szárítjuk, majd etilaoetát-petroléter-elegyből átoldjuk. A kapott 17,01 g amorf por alakú terméket 5,15 15 ml trietilaminnal együtt 170 ml vízmentes tetrahid-rofurániban feloldunk, ezt az oldatot —15"ra lehűtjük és 5 perc leforgása alatt 4,44 ml izobutilklórkarbonát, 2,5 ml vízmentes tetrahidrofuránban képzett elegyével elkeverjük. 15 20 percig tartó keverés után —10°-on az elegyhez 107 ml 0,64 n vízmentes etüacetátban készített amimóniumoldatot csepegtetünk, és még 1 óra hosszat 0°^on, majd 6 óra hosszat 20°-on keverékben tartjuk. A reakciókeveréket ezután 25 erősen bepároljuk, a ragacsos maradékot 500 ml etilacetátban feloldjuk, egymásután vízzel, 2 n nátriumkairbonátoldattal, végül ismét vízzel mossuk, azután szárazra pároljuk. A maradékot etilacetát-petroléterből kétszer átoldjuk 30 és nagyvákuumban szárítjuk. 14,4 g amorf por alakú terméket kapunk, amely vékonyrétegű kromatografálás során egységesnek bizonyult. Szilikagéllemezen a következő R/-értékek adódnak: 35 R/ (9 : 1) klorofrm-metanol = 0,35 R/ (43A) = 0,63 2. H-Val-Tyr-Pro-NH2 40 14,4 g Z-Val-Tyr-Pro-NH2 -ot 150 ml metanolban feloldunk és az oldatot 1,5 ,g 10%.-os palládiumos aktívszén jelenlétében légköri nyomáson és széndioxidos abszorpció közben az oldat telí-45 téséig (kb. 2 óra hosszat) hidrogénezünk. A katalizátor kiszűrése és a szűrlet bepárlása után a kapott maradékot 15 ml metanol és 40 ml etilaoetát elegyében feloldjuk, ehhez 120 ml petrolétert adunk, így a terméket kicsapjuk, 50 leszűrjük és 40°-on nagyvákuumban szárítjuk. 9,52 g amorf por alakú terméket kapunk, amely cellulózalemezeken végzett vékonyrétegű kromatografálás során egységesnek bizonyult. A kapott R/-értékek a következők: 65 R/ (40) = 0,73 R/ (45) = 0,72 R/ (54) = 0,70 60 3. Z-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NH2 9,74 g Z-Lys(BOC)-OH és 9,52 g H-Val-Tyr-Pro-NH2 keverékét 40 ml vízmentes dimetilformamidfoan feloldunk és az oldathoz 5,76 g 65 diciklohexilkarbodiimid 100 ml aoetonitrilben 6
