156076. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-Rh globulin előállítására
5 hogy 1 liter plazmára számítva 177 ml 71 térfogatszázalékos (v/v) metanolt adagolunk. A kapott oldatot —5 C° ± 0,5 C°-on 1 óra hoszszat lassan keverjük, majd keverés után éjjelen át —5 C° ± 0,5 C°-on tartjuk. Állás után r. az oldatot 3 szárnnyal ellátott dobot tartalmazó Sharples-féle szupercentrifugában —5 C* ± 0,5 C° hőmérsékleten centrifugálásnak vetjük alá, az adagolási sebességet pedig percenként 1000 ± 100 ml-re szabályozzuk. A I. io felülúszó fázist hűtött edényben gyűjtjük össze. 1 liter I. felülúszó fázisra számítva hűtés közben 601 ml 71 térfogatszázalékos (V/V) metanolt, 0,88 ml 10 n ecetsavat és 0,44 ml 4 15 n nátriumacetátot adunk hozzá. Ily módon a metanolkoncentrációt 33,3% ± 0,5%-ra, a rendszer ionerősségét 0,086 ± 0,005% g ion/liter és pH-értéket pedig 6,9 állítjuk be. Az: oldatot —5 C° ± 0,5 C°-ra hűtjük és két óra hosszat 20 lassan keverjük. Keverés után az oldatot 16 óra hosszat —5,5 C° ± 0,5 C°-on állni hagyjuk. Állás után az oldatot 3 szárnnyal ellátott dobot tartalmazó Sharples-féle szupercentrifugában —5 C° ± 0,5 C° hőmérsékleten, percen- 25 ként 1000 ml ± 100 ml sebességgel lecentrifugáljuk. A kapott II. + III. csapadékot a centrifugaedényből eltávolítjuk és —20 C°-on tároljuk. Ezután a hőmérsékletet 0 C°-ra állítjuk be 3G és II. + III. csapadékot kétszeres térfogatú (a II. -f- III. csapadék eredeti súlyára kétszeres mennyiségű) víz-jég keverékben 0 C°-on szuszpendáljuk oly módon, hogy a pasztaszerű anyagot saválló acélból készített spatulával 35 saválló edényben keverjük, míg homogén szuszpenziót kapunk. A szuszpenzióhoz háromszoros térfogatú (a II. + III. csapadék eredeti súlyának háromszorosa) 0,0187 mólos dinátriumfoszfátos oldatot adunk keverés közben. 40 Ezután 0 C°-on húszszoros térfogatú (a II. és III. csapadék eredeti súlyára számítva húszszoros) vizet adunk hozzá 0 C°-on és a rendszert 0 C°-on 30—60 percig keverésben tartjuk. A rendszer pH-értéke 7,2 ± 0,2. Abból a 45 célból, hogy az oldat metanolnszázalékát 26,7 ± 0,2%-ra állítsuk be, tizenötszörös térfogatú (II. -f- III. csapadék eredeti súlyára számítva tizenötszörös) 71 térfogatszázalékos (V/V) metanolt adagolunk —10 C°-on. Az oldat ion- 50 erőssége 0,0052 ± 0,0005 g ion/liter. Az oldatot —5 C°-ra állítjuk be, és 3 szárnynyal ellátott centrifugaedényt tartalmazó Sharples-féle szupercentrifugában —5,5 C° ± ± 0,5 C°-on 500 + 50 ml/perc sebességgel le- 55 centrifugáljuk. A kapott II. + III. W csapadékot az edényből eltávolítjuk és lemérjük. A II. + III- W csapadékot kétszeres térfogatú (II. + III. W csapadék súlyának kétszerese) jeges vízben szuszpendáljuk. A szuszpen- 6ü zióhoz kétszeres térfogatban (II. + III. W csapadék súlyának kétszerese) 0,175 mólos nátriumacetátot adunk. Ezután a pasztaszerű II. -f- III. W csapadék minden egyes gramjára számítva további egyszeres térfogatú (a II. + 65 6 -f- III. W csapadék súlyára számítva egyszeres) 0,216 ml acetátos puffert tartalmazó jeges vizet adagolunk. Az acetátos puffert úgy készítjük, hogy 40 ml 10 n ecetsavat és 20 ml 4 n nátriumacetátot desztillált vízzel 100 ml-re hígítunk. Az oldat pH-értéke 5,2 ± 0,2. Ezt az oldatot 1 óra hosszat lassú keverésben tartjuk, majd 13,5-szeres térfogatú (II. ± III. W csapadék eredeti súlyára számítva 13,5-szeres) jegesvizet és 8,66-szoros térfogatú (II. + III. W csapadék eredeti súlyára számítva 8,66-szoros) 71 térfogatszázalékos (V/V) metanolt adunk hozzá és az oldat hőmérsékletét —6 C° + 0,5 C-on tartjuk. Ezen a hőmérsékleten 1 óra hosszat lassú keverésben tartjuk, majd éjjelen át állni hagyjuk. Az oldat 22,7 ± 2% metanolt tartalmaz, 5,2 ± 0,2 pH-értékű és ionerőssége 0,0013 ± 0,005 g ion/liter. A fenti oldatot 3 szárnnyal ellátott dobot tartalmazó Sharples-szupercentrifugában —6 Cc + 0,5 C°-on 500 ml ± 50 ml percenkénti adagolási sebességgel lecentrifugáljuk. A kapott III. felülúszó fázis térfogatát mérjük, míg a III. csapadékot elöntjük. A III. felülúszó fázist 0,4% (súly/térfogat) Celite 512-vel kezeljük és 20 percig keverjük. A keveréket D—8 szűrőlapot tartalmazó Ertel-féle szűrőprésen szűrjük. 5,2 pH-értékű acetátos puffert készítünk az alábbi módon: 25 ml 4 n nátriumacetátot és 3 ml 10 n ecetsavat desztillált vízzel 100 ml-re felhígítunk. Az acetátos puffert 22,7%-os metanollal 100-szoros térfogatra hígítjuk. A kapott oldat ionerőssée 0,01 g ion/liter. Ertel-f éle szűrőprést a fenti acetátos puff érrel -f-f Celite 512-vel (0,5 gm/6,45158 cm3 szűrőfelület) előkezelünk (precoat-képzés), és ehhez a kezeléshez 6,45158 cm2 -nyi szűrőfelületre számítva 40 ml acetát-metanolos puffert használunk. A III. felülúszó fázist a fenti szűrőprésen leszűrjük és a szűrlethez 1 liter leszűrt III. felülúszó fázisra számítva 50 millimól (2,923 g) nátriumkloridot és 7,65 milliütei 1 mól nátriumhidrogénkarbonát-oldatot adunk. A szűrlet pH-értéke 7,2 + 0,2, ionerőssége 0,06 ± 0,005 g ion/liter. A kapott szűrlethez —5 C° alatti hőmérsékleten 160 térfogatrész 100%-os metanolt adunk, így a mietanolkoneentrációt 33,2 ± 0,2%-ra állítjuk be. Az elegyet —6,5 ± 0,5 C°-on 1 óra hosszat lassú keverésben tartjuk, majd éjjelen át állni hagyjuk. Állás után az oldatot 3 szárnnyal ellátott dobot tartalmazó Sharples-féle szupercentrifugában —6 C° + 0,5 C° hőmérsékleten és percenként 500 ± 50 milliliter adagolási sebességgel lecentrifugálj ük. A felülúszó fázist elöntjük. A kapott II. csapadélkot a centrifugából eltávolítjuk és négy-ötszörös térfogatú jeges vízben szuszpendáljuk és fagyasztással szárítjuk. A fagyasztással szárított por alakú terméket lemérjük és —5 C°-on vagy ez alatti hőmérsékleten tároljuk. 1
