156058. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11 béta-hidroxiszteroidok előállítására
3 nálunk, a hozam nem csökken, hanem csak a reakció lesz késleltetett. Az S-2H-acetát mikrofoiológiai/enzimatikus átalakítása lassabb, mint az S-vegyületé, míg az F-vegyületet ebből hasonlóan alacsony, kb. 40%-os hozammal kapjuk. 5 A találmány szerinti eljárással mégis a hozam különösen jelentős javulását értük el. Így az S-vegyület 17a-aoetátját gyorsan, 96%-os kitermeléssel az F-vegyületté vagy az F-vegyület és az F-vegyület 17ia-acetátjának keverékévé 10 alakíthatjuk. Ha kiindulási anyagként 17a-észtereket alkalmazunk, először egy 17ia-acil0XHll/?4ridroxiszármazékot nyerünk, ezt az inkubáció folyamán azután teljesen vagy részlegesen 11:/J,17«- 15 -dihidroxi-szteroiddá alakítjuk. Az el nemszappanosodott 17a-észterökből kémiai úton pl. nátriummetanoláttal reagáltatva jó termeléssel nyerhetjük a szabad alkoholokat. Az egyetlen követelmény a kiindulási anyag- 20 ként alkalmazott szteroiddal szemben az, hogy 17a helyzetiben olyan hidroxil-csoport legyen jelen, amelynek hidrogénatomja szerves gyökkel van helyettesítve, valamint lil-.es helyzetben 2 hidrogénatomot tartalmazzon. A kiindu- 25 lási szteroidok a pregnán-, androsztán- vagy pedig az ösztrán sorozot tagjai lehetnek. A szokásos módon helyettesítve lehetnék, és kettős kötéseket is tartalmazhatnak. Így a 17-es helyzetben észterezett vagy éterezett hidroxilcso- so porton kívül alkil-, alkenil-, alkinil-, l-hidroxietil-, il,2-dihidroxietil-, aeetil- vagy hidroxiacetiksoport lehet jelen. A molekula egyéb helyzeteiben, így 3-as vagy 16-os helyzetben levő hidroxilcsoportok, észt erezett vagy étere- 35 zett hidroxilcsoportok, valamint az oxocsojportok nem zavarják a reakciót. Jelen lehetnek alkilcsoportok is pl. 2-es, 4-es, 6-os és/vagy 16-os helyzetben, vagy pedig halogénatomok pl. 4-es, 6-os, 7-es, 9-es, 12-es vagy 2il-es helyzetben. 40 Továbbá, a molekula tartalmazhat kettős kötéseket is, azzal a feltétellel, hogy a 11-es helyzetű szénatomhoz két hidrogénatom kapcsolódjon. A kiindulási anyagok ezen kívül tartalmazhatnak egy kondenzált heterociklusos gyűrűt is, 45 pl. a 2-es és 3-as szénatomoknál. Végül lehetnek ,17- és/vagy 19-nor-származékok is. A kiindulási anyagok lVíanhidroxilcsoportja előnyösen észterezve van, mert az észtercsoportok távolíthatók el a legkönnyebben, de 50 megfelelőek a 17«-éterezett hidroxilcsoporttal rendelkező vegyületek is. Az észterek lehetnek például lícHacetátok, propionátok, kapironátok, benzoátok, a ciklohexánfcarbonsav észterei és hasonlóak, míg az éterek között megemlíthet- 55 jük az alkil-, tritil- és tetrahidropiiranil-étereket. Ha a kiindulási anyag a 17a-helyzetben levő hidroxilcsoporton kívül egyéb hidroxilcsoportokat is tartalmaz, ezek szintén észterezve vagy 60 éterezve lehetnek, ez nem befolyásolja a 11/3--hidroxilezett termék hozamát. A jelenlevő szubsztituensek a hidroxilezés sebességére hatnak, így a ll7ia,i2ll-diaciloxiszte:roidok líl/?-hidroxilezése sokkal lassabban megy végbe, mint a 65 4 megfelelő 17a-aciloxi-2il-hidroxiszteroidoké, bár a diaciloxi-származékokból kiindulva ugyanolyan termeléssel kapjuk a terméket. A kiindulási anyagokat a hagyományos mód>szerek segítségével állíthatjuk elő, pl. a megfelelő 17!a-hidroxi-szte:roidok savas katalizátorok, így pl. p-toluolszulfonsav vagy perklórsav jelenlétében végzett acilezése útján. Így az S-vegyület 17ía,2il-diacetátját ecetsavanhidiriddel állíthatjuk elő ecetsavas oldatban, katalizátorként p-toluolszulfonsavat használva [Id. Turner, R. B. J. Am. Chem. Soc. 75, 3489 (1953)]. Ha a szteroidok dihidroxiaceton-oldallánoot tartalmaznak, mint pl. az S-vegyület, a 17a-mono-észterek előnyösen az crto-észtereken keresztül állíthatók elő a Gardi, R. és munkatársai által leírt módon [Id. Gazzetta chimica italiana 93, 431—460 (1963.)]. Felhasználható Curvularia fajok a 2i 668 028 lsz. amerikai szabadalmi leírásban említett Curvularia falcata, C. bnachyspora, C. lunata és C. pallescens, de egyéb Curvularia fajok is alkalmazhatok, pl. Curvularia geniculata Tracy et Earle (Boedijn). Mikrobiológiai átalakítás céljára a Curvularia gombát megfelelő táptalajon keil tenyészteni, amely főleg szénhidrátokat, sókat, szerves és szervetlen nitrogént tartalmaz. Egyéb hasznos anyagok a növekedési serkentőanyagok, így a B-vitaminok. Szén-forrásként előnyösen glükózt vagy szacharózt használhatunk. Nitrogén-forrásként kukomealekvárt vagy szójabab-darát alkalmazhatunk, a kukoricalekvár előnyösebb, mert abban már jelen vannak a növekedési serkentőanyagok. A szteroid kristály-szuszpenzió vagy megfelelő oldószerrel készített oldat alakjában adjuk a kultúrához. Az oldószer aceton, propilénglikol vagy dimetilformaímid lehet. Ezután folytatjuk a kultúra levegőztetését, hogy gyorsítsuk a mikroorganizmusok növekedését és a szteroidok oxigénezését. Néhány esetben előnyös, ha a szteroidot akkor adagoljuk be, amikor a mikroorganizmusok aerob körülmények között már megnőttek. Eljárhatunk úgy is, hogy a mikroorganizmusokat tenyésztés után elkülönítjük a táptalajból, és újra desztillált vízben vagy fiziológiai só oldatban szuszpendáljuk, amelyben már jelen van az oxidálandó szteroid vagy amihez hozzáadjuk azt. Micélium helyett alkalmazhatjuk a mikroorganizmus spóráit is, vagy az organizmus enzimfcászítményét [ld. Zuidweg és munkatársad Biochim. Biophys. Acta 58, 131 (1962)]. A reakcióidő a szteroid természetétől és koncentrációjától, valamint az alkalmazott Curvularia fajoktól függően 10—90 óra lehet, míg a fermentálás hőmérséklete 20' C° és 37 C° között változhat. Általában a szteroidot 10 g/l vagy ennél kisebb koncentrációban alkalmazzuk aszerint, hogy az adott körülmények között a szteroid milyen sebességgel reagál. Miután az oxidálás befejeződött, a terméket megfelelő, vízzel nem teljesen elegyedő oldószerrel extrahálhatjuk a szűrt vagy centrifugált 2
