155679. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mitramicin előállítására mikrobiológiai úton

A fermentációt 0,5—1,5 l/l/perc sebességgel, célszerűen 0,8—1,2 l/l/perc sebességgel levegőztetjük. Nitrogénforrásként amerikai mogyorólisztet és kazein-hidrolizátumot, szén- és energiaforrásként glicerint és glükózt alkalmazunk. Az antibiotikumot, melynek izolálása a szakirodalomból ismert {Act. Un. Intern. Contr. Cancr. 20, 291 (1964)] különböző módszerekkel összehasonlítottuk a rokon antibiotikumok autentikus mintáival, és megállapítottuk, hogy a termelt anyag a mitramicinnel azonos. A törzs leírása a „Methods Manual (Internat. Cooperative Project for Description and Deposition of Type Cultures of Streptomycetes) Delaware, Ohio, 1964" követelményeinek megfelelően a következő: A légmicélium a cinereus-, a szubsztrátmicélium a flavus-brunus színcsoportba tartozik. Keményítő-agar: a légmicélium „Gray-series, 3ge", a szubsztrátmicélium „Yellow, Co 44", oldódó pigment nines, rectus flexibilis 3—4%, retinaculum 15—20%, a többi spirál. Glieerin-aszparaginrtigar; a légmicélium „Gray-series, 5fe, a szubsztrátmicélium „Yellow, Co39", oldódó pigment nincs. A sporuláció nem értékelhető. Burgonya-agar: a légmicélium igen fejlett, porszerű barnásszürke, ill. hamuszürke. Erőteljesen növekedő, felgyürődő sötétbarna szubsztrátmicélium. Sötétbarna oldódó pigment. Gauze-féle keményítő-agar: a légmicélium porszerű, világosszürke. A szubsztrátmicélium fejlett, színtelentől világosbarna, lepelszerű; oldódó pigment nincs. Nutrient-agar: légmicélium nem fejlődik, a szubsztrátmicélium fejlett, gyűrt, barna, lepelszerű. Fekete oldódó pigment. Jensen-féle kazein-agar: fejlett, porszerű, barnásszürke légmicélium, gyenge, színtelen, lepelszerű szubsztrátmicélium. Oldódó pigment nincs. Szaharóz-nitrát-agar: légmicélium nincs, erősen fejlett, piszkosfehér, ül világosbarna, lepelszerű szubsztrátmicélium. Oldódó pigment nincs, ill. balvénybarna. SziKtetikus~agar: légmicélium nincs, fejlett világossárga, lepelszerű szubsztrátmicélium; világos, sárgásbarna oldódó pigment. Glukóz-a$zpara§in-agar: igen fejlett, porszerű, hamuszürke, ül. barnásszürke légmicélium, fejlett, színtelen, gyűrt, lepelszerű szubsztrátmicélium; világossárga, oldódó pigment. Triptaiv-élesztőkivotmt~agar: légmicélium nincs, gyenge, színtelen, lassan barnuló, lepels?erű szubsztrátmicélium; fekete, oldódó pigment. Zafep«fc«íy-a#ar: fejlett, porszerű, baroássstürfee, ül. hamuszürke légmicélium, fejlett, élénksárga, össEefmggő, lepelsjseríl saubsztratmicélium; világ«sárga oldódó pigment. Zselatin tápközeg: légmicéüuro nincs, a ssmbssítrátmicélium fejlett, gyűrt, sötétbarna. Fekete oldódó pigment. Erőteljes folyósítás. fúrompgenitás vaspepton-agaron: erősen pozitív, Jfíírét-reclwfceiő: »egatív. 4 C-forrás értékesítési spektrum: (— = növekedés és értékesítés nincs; + =* növekedés nyomokban; + = gyenge, + += közepes és + + + = erőteljes fejlődés, illetve hasznosítás): d-glukóz (+ kontr.): + + +; C-nélkül (neg. kontr.): —; melibióz: + + + ; arabinóz: ++ + ; d-fruktóz: ++ + ; d-mannit: +++; raffinóz: + + + ; ramnóz—; szaharóz: + + + ; d-galaktóz: + + -+•; inulin: +++, dulcit: —; szalicin:+•+•; d-szorbit: ±; laktóz: + + +; izonit: + + +; trehalóz: + + + ; d-xilóz: -M—h Mikromorfológia: a spórafelület (elektr. opt.) sima. A sporofórok típusa: többé-kevésbé szabályos, 2—7 kanyarulatú spirálok. A közölt adatokból kitűnik, hogy az 1-515 jelű törzs jelentősen különbözik a Streptomyces tanashiensis és Actinomyces atroolivaceus fajoktól, és az Actinomyces iverinivel azonosítható, mellyel kapcsolaban mitramicin termelését nem állapították meg. A Streptomyces argillacues n. sp. faj leírása ez ideig nincs leközölve. A fermentáció befejezése után az erjesztése« oldat feldolgozására a következő izölálási eljárást alkalmaztuk. A savas pH-n szűrt erjesztéses oldatot etilacetáttal extraháltuk nátriumklorid jelenlétében. Az etilacetátos kivonatból 0,05 n vizes nátriumhidroxid-öldatba vittük át az antibiotikumot. A nátriumhidroxidos oldatból pH 4-re történő savanyítás után kloroformmal vagy etilacetáttal vontuk ki az aktív anyagot. A nyert kivonat bepárlási maradékából éteres kicsapással előállítottuk a hatóanyagot. Ügy is el lehet járni, hogy az etilacetátos kivonatot közvetlenül, tehát lúgos kezelés nélkül bepároljuk, majd éterrel kicsapjuk a hatóanyagot. A nyers antibiotikum nem bizonyult egységesnek, mert a mitramicin mellett egy kisebb biológiai aktivitású komponenst is tartalmazott. A további tisztítást úgy végeztük, hogy a terméket 4-es pH-jú vizes oldatból etilacetátba átoldottuk, majd alumMumoxid-oszlopon kromatografáltuk, amivel sikerült egységes mitranücinhez jutnunk. Az elválasztott melléktermék biológiai aktivitása a tiszta mitramicin aktivitásának mintegy 20%-a. A kromatográfiásan tisztított mitramicin vüágossárga, mikrokristályos por, mely 177—179 C°-on olvad. Fajlagos forgatóképessége (a)D

^ •»—56,5° (c«0,2 metanolban), mtraibolya elnyelési színképének maximumai 237, 282 és 420 mi».-nál vannak metanolban, 315 mfi-nál inflexió lép fel. Ezek az állandók megegyeznek a mitramicin izolálásánál leírtakkal. Az 1-515 jelzésű Streptomyces iverini törzs fermentlevéből izolált antibiotikum infravörös elnyelési színképe is azonosnak mutatkozott a mitramicin hasontó spektrumával [Antibiotics and Chemotfaeraphy 12, 182 .(196S)]. éz általunk izolált mitramicin C- és H-aaalízis-adatai is megegyeznek a mitramicin megfelelő értékeivel (C 56,04; H 8,8€%). Rétegkromatográfiás vizsgálataink során (KieseJgel-G rétegen) az általunk izolált antibioti-2