155365. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 16.511 R. P. antibiotikum és összetevői előállítására
155365 35 kukoricalekvár glukóz szójaolaj ammóniumszulfát koibalt'klorid-hexahidrát vízvezetéki vízzel kiegészítve 36 11 kg 1:9,25 kg 8,215 liter 1,1 kg 27,5 g 510 literre A keverék pH-jának 1100 ml tömény nátronlúggal (d = 1,33) 6,! 85-re való beállítása után hozzáadunk 2,75 kg 'kalciumkarbonátot, majd 122 C°-os gőznek 40 percig való átbuborékoltatásával sterilizáljuk. Lehűlés után a táptalaj térfogata 550 liter és a pH-ja 6,75. Ekkor beoltjuk a fentemlített 170 literes fermentorban készült 55 liter oltótenyészettel. A tenyésztést 25 C°-on 87 óra hosszat végezzük egy percenként 205 fordulatú turbinakeverővel való keverés és óránként 25 m3 steril levegővel való levegőztetés közben. Ekkor a közeg pH-ja 7,45, a tenyészlé térfogata pedig 560 liter lesz. Az antibiotikumtartalom ekkor 555 E/ml. 12. példa: biológiai aktivitás: 2170 E/mg elemi összetétel: C 6:2,6, H 7,5, O 25,2, N 4,05% ultraibolya színkép 10 mg/l-es metanolos oldatban : 'EÍ'cm = 46S 2; 3 ;2 nm-nél (I maximum) ^1% •^l em = 165 345 nm-nél (II maximum) Vékonyréteges kromatográfia, hordozó Kieselgel H oldószer etilacetát: Rf = 0,l, 0,2, 0,35, 0,60. 10 15 20 25 A 11. példában leírt módon kapott 560 liter tenyészlevet keverővel ellátott tartályba bocsátjuk. A pH-ját 3,5 liter 5 n nátronlúggal beállítjuk 9,5-re, és félórai keverés után hozzáadunk 22,5 kg szűrés-segítőt, és a szuszpenziót 30 szűrőprésen átszűrjük. Ezután a szűrőlepényt 100 liter vízzel mossuk. A 600 liter szűredéket 7 pH-nál térfogata 50%^ának megfelelő menynyiségű metilénkloriddal extraháljuk, kétfokozatú ellenáramú centrifugákat alkalmazva. A £5 kapott 220 liter szerves oldószeres kivonatot 8 pH-nál 22 liter vízzel, majd 4 pH-nál ismét 22 liter vízzel mossuk. A mosott kivonatot ezután 20 torr nyomás alatt, 25 C°-on egy recirkulációs sűrítőben 11 literre sűrítjük. A koncentrá- 40 tumot 50 g aktívszénnel kezeljük, és szűréssegítő hozzáadása után szűrjük. A szűredéket Visszavisszük a sűrítőbe, és 1 liter térfogatig sűrítjük. Ezután az antibiotikumot 10 liter hexánnal kicsapjuk, a csapadékot elkülönítjük, 45 mossuk és szárítjuk. így 85 g 16 511 R. P. antibiotikumot kapunk a következő jellemző tulajdonságokkal: etilacetátíban. Ezt az oldatot felvisszük egy etilacetátban szuszpendált 1 kg Kieselgelt tartalmazó oszlopra (a Kieselgelt szuszpendálása előtt M/15 foszfátpufferral 5 pH-ra pufferoltuk, majd 12 óra hosszat 110 C°-on szárítottuk). A kromatográfia hordozó magassága az 5 cm átmérőjű oszlopban 101 cm. A feladás üteme 2400 ml/h. A kezdeti oldat átfolyása után a krotogrammot etilacetáttal előhívjuk. Az első 2 liter távozta után összegyűjtjük a középső, 5 literes frakciót, amely a 16 511 R. P. antibiotikum B összetevőjét tartalmazza. Ezt a frakciót 20 torr nyomás alatt egy pillanatbepárlóban 25 C°-on 300 ml-re sűrítjük. Ezután a koncentrátumot 3 liter hexánnal kicsapjuk. A terméket elválasztjuk, mossuk, és szárítjuk. Így 57 g 18 051 R. P. antibiotikumot kapunk a következő jellemző tulajdonságokkal: biológiai aktivitás: 2840 E/mg elemi összetétel: C 64,9, H 8,2, O 22,75, N 4,05% ultraibolya színkép 10 mg/l-es metanolos oldatban : 600 233 nm-nél (I maximum) 50 55 TT 1( <» "lem E i'cm = 270 350 nm-nél (II maximum) [a]22D = —109 ±3° (c = 1, metanolban) vékonyréteges kromatográfia: hordozó: Kieselgel H oldószer etilacetát: Rf = 0,2. 14. példa: A 13. példában leírt módon készült 10 g 18 051 R. P. antibiotikumot 200 ml vízben szuszpendálunk. Az oldatot fokozatosan meglúgosítjuk n nátronlúggal. Az oldódás 10,4 ml nátronlúg hozzáadására következik be, a pH ekkor 9,5. Az oldatot megszűrjük, és liofilizáljuk. 8,6 g 18 051 R. P. antibiotikumot kapunk nátriumsója alakjában a következő jellegzetes tulajdonságokkal : biológiai aktivitás (diffúzió alapján): 2100 E/mg elemi összetétel: C 65,5, H 9,6, O 20,8, N 3,5, Na 2,7% ultraibolya színképe 10 mg/l-es metanolos oldatban : Ei'cm =617 233 nm-nél (I maximum) Ei em = 390 355 nm-nél i(II maximum) [a ]22 D = —138 ±3° (c = 1, metanolban) 15. példa: A 11. példában leírttal azonos módon dolgozva, de „Streptomyces lavendulae 22 097" törzset felhasználva, 67 E/ml aktivitású tenyészlevet kapunk. 60 16. példa: 13. példa: A 15. példában kapott levet a 2. példában leírt módon kezelve 6,6 g 16 511 antibiotiku-A 12. példában leírt módon készült, 2170 mot kapunk. Ennek ultraibolya színképe 10 E/mg aktivitású 85 g terméket feloldunk 850 ml g5 mg/l-es metanolos oldatban a következő: 18
