155254. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi kortikotropin szintézisére

155254 19 20 35. lépés: BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OBuf

)-His-Phe-^Arg-Try-Gly-LyS!(BOC)-Pro-Val-Gly-OH • HCl (1—14) C9

iH,

340

23ÍN

22

SC1

,(1,971,68). Aminosavanialízis: Ser 1,05 (2), Tyr 0,95 (1), Met 1,0 (1), Glu 1,0 (1), His 1,05 (1), Pihe 1,0 (1), Arg 0,i9S (1), Gly ,2,0 (2), Lys 1,05 (1), Pro 0,05 (1), Val 1,05 (1). (ahol a zárójelben levő számok az elméleti értékeket jelentik). 37. lépés: BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-GluíOBu^-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lysi(BOC)-Pro-Val-Gly-,Lysi(BOC)-,Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lysi(BOC)-V:al-Tyr(But

)-Pro-AspíOBiu^-Ala-Gly-GluíOBu^-AsptOBut)-Gln-Ser-Ala-Gl'u(OBut

)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-OBuO-Phe-Obut- 3 HCOOH (1—30) 202 mg (0,055 :mimól) penta&ozapeptid-triklórhidrátot (1. példa 23. lépés), 11,8 mg (0,060 mmol) védett tetradekapeptidet (1. példa 36. lépés), 38 mg (0,144 mmól) pentafclórfenolt és 30 mg (0,145 mimól) diciklohexilkarfoodiimidet feloldunk 0,6 'ml dimetilformamidban, mely 0,077 ml (0,055 mmól) trietilamint is tartalmaz. A reafccióelegyet állni hagyjuk szobahőmérsékleten 4 napon át, majd peroxidimentes éterrel hígítjuk, a kivált csapadékot szűrjük és éterrel mossuk, szárítjuk. A nyers terméket etilacetát-piridin-hanigyasav-víz eleggyel kromatografáljuk sziliíkagél oszlopon. A főterméket tisztán tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk és peroxidmentes éterrel eldörzsöljük. A főterméket is tartalmazó frakciók összegyűjtéséből származó anyagot ismét kroimatografáljuk. Összesen 186 mg (44%) védett nonatriaikontaipeptidet kapunk. Rf7 0,3<V

— 0,37. C207H418O73.N57S (5612-2,54). 38. lépés: Ser-Tyr-Ser-Met-GlunHis-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gm-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe (ctft-ACTH) 1O0 mg védett nonatriakontapeptidet (1. példa 37. lépés) feloldunk 2, ml trifluoreicetsavban, majd az oldatot 15 perc után bepároljuk vákuumban. A maradékot oldjuk 2 ami vízben és ismét bepároljuk. A vizes oldást és bepárlást még egyszer megismételjük és végül a maradékot feloldjuk 5 ml vízben és acetát ciklusban levő Amberlite ERA—400 gyantán átfolyatjuk, 20 ml vízzel moissuk. A vizes oldatokat egyesítjük és liofilízáljuk. A liofilizátum 80 mg (kb. 80%). Rf8 0,23-^0,30. Aminosavanialízis: Asp 1,8 (2), Ser 2,7 (3), Glu 4,5 (5), Pro ,3,8 <4), Gly 2,9 (3), Ala 3,0 (3), Leu 1,0 (1), Val 2,9 (3), Met 0,95 (1), Tyr 1,9 (2i), Phe 3,0 (3), His 0,9 (1), Lys 3,8 (4), Arg 2,8 (3), Tyr : Try 2,2 (2). 2. példa: 1. lépés: Z-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(But

)-Pro-OSu (20—24) 400 ml vízmentes dioxánban feloldunk 51,5 g Z-Val-LysiíBOiCÍ-Val-TyríBu^-Pro-OH pentapeptidet (1. példa 2,3. lépés) és 13,2 g N-hidroxiszuíkcinimiidet, majd jeges vizes hűtés mellett 12,1 g diciklothexilkaribodiitmidet adunk hozzá. Fel óráig hidegen tartjuk, majd másnapig szdbahőimlérsékleten állni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a 10 15 20 25 S0 35 40 45 50 55 60 H^Glu((O,Bu0-His^PheHArg-Try-Gly-íLys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH-'BCl (5—14) 5 3,5 g védett dekaipeptidet (1. példa 34. lépés) 80 ml metanol — 10 ml víz — 1 ml jégecet elegyében hidrogénezünk csontszenes palládium jelenlétében. A reakció végén a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk és a imaradékot 10 10 ml metanol-oldatíból 100 ml éterrel kicsapjuk. A csapadékot szűrjük és szárítjuk. 3,0 g (100%) szabad dekapeptidet kapunk. Rf1

0,05— 0,10. 15 36. lépés: 3,1 g BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-iN2H3 peptidhidrazidot [B. Iselin és R. Sdhwyzer: Helv. Ghím. Acta 44, 169 (11961)] feloldunk 15 ml dimetilformamidiban és —30 C° hőmérsékleten hozzá- 25 adunk 2,35 ml 6 n sósavait, majd 410 mg nátrium-nitrit tömény vizes oldatát. A keletkezett azid-öldatot azonnal hozzáöntjük 3,5 g dekapeptid (1. ipélda 35. lépés) és 2,1 ml trietilaimin 15 ml diimetilformamidban készült ol- 30 datához, ímelyet előzőleg —20 C°-ra hűtöttünk. A reakicióelegyet egy óra hosszat —10 és —20 C° közötti hőimérsékleten keverjük, majd éjszakán át 0 C° hőmérsékleten állni hagyjuk. A reakcióelegy bepárlása után a maradékát víz- 35 zel porrá dörzsöljük ós 150 g szililkagélen kro,mat,ografálj,uk etilacetát-piridin-ecetisav-víz (60:20:6:11) elegyben. A főterméket tisztán tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk. A párlási maradékot, 1—2 g piridin-Mór- 40 hidrátoit adva hozzá feloldjuk 20'—30 ml metanolban, betöményítjük, majd vízzel kicsapva porrá dörzsöljük, szűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. 2,3 g védett dekapeptid-klóirhidrátot kapunk. Rfi 0,10—0,15. 45 10