155167. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pektináz levegőztetett mélykultúrában történő bioszintézisére és az enzimfehérje oldatából való kinyerésére
jutottunk, hogy ha egyes gombafajok folyékony tápközegének egyik komponenseként metoxicsoporttal 59—35%-ig észterezett a-D-poligalakturonsav egységeket tartalmazó nagymolekulájú poliszaccharidokat adagolunk, e vegyület a gombafajok intra- és extraeeHuláris pektolitikus hatású enzimfehérjéinek képződését olyan mértékben felfokozza, hogy bármilyen volumenű tenyésztérfogatban történő tenyésztés esetén is jó kitermelési mutatókkal lehet a képződött enzimfehérjéket izolálni. A találmány szerinti eljárás kialakítására teremtett lehetőséget az a további felismerés, hogy a cukorgyártás egyik melléktermékeként kapott szárított cukorrépaszelet olyan mértékben tartalmaz 59—85%-íg észterezett a-D-poligalakturonsav egységeket, hogy a cukorrépaszelet vizes szuszpenziója induktor ként szolgálhat egyes, induktív úton bioszintetizálható pektolitikus enzimfehérje képzésére képes fonalas gombafajok nagy volumenű (1000:—1600 liter) alámerített tenyésztése során. A találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez alkalmas mikroorganizmusként — számos átvizsgált gombafaj közül — az alábbi morfológiai tulajdonságokkal rendelkező törzset választottuk ki: Czapek agáron 10 napos, 2i5 C°-on való tenyésztés után: sárgás, zöldbe hajló levegőhifákkal rendelkező telepek 2,0—3,5 cm átmérővel. A konidiumfejek nagyok, szerteágazók, 300—500 /j, átmérőjűek. Színük sárgásbarna. A konidiofórák hossza 120—150 fi, átmérője 10—15 ,«, színtelen sejtfallal. A konidiumok enyhén sárgás színűek, hosszú láncban fejlődnek, enyhén elliptikus alakúak, 2,5—2,8 /x átmérőjűek. A primer sterigmák 7—12 /Í/3,5—4y8 fi, a szekunder sterigmák 6,0—7,0 /i/2,0—3,0 i-i átmérőjűek. A szklerócium sötétbarna, fekete színű, ez a telep domináns jellemvonása. Rizskultúrán, 25 C°-on való 7 napos tenyésztés után: erős növekedés, olívzöld levegőhifák, sima konidioforákkal, és 500—5:50 ji átmérőjű konidiumokkal. Sűrű spóraképzés. Rendszertani meghatározására irányuló munkáink alapján a törzs az Aspergillus alliaceus Thom and Church faj egy variánsának bizonyult. (THOM, C, and RAPER, K. B., A Manual of the Aspergilli. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1945. pp. 246-^247.) A törzset az Országos Közegészségügyi Intézetben letétbe helyeztük. Az enzim szilárd formában történő izolálására nyílt mód azzal a további felismeréssel, hogy az enzimfehérje szűrhető csapadék formájában csak akkor választható ki oldatából, az aktivitás lényegesebb csökkenése nélkül, ha az oldat pH-ját az ammóniumszulfáttal történő kisózás során a 3,0—2,5 értéktartományban tartjuk. Ezen felismerések alkalmazásával nyílt lehetőség arra, hogy pektolitikus enzimfehérjét ipari méretben, alámerített levegőztetett kultúrában állítsunk elő és azt az oldatból szilárd formában olyan aktivitással izoláljuk, hogy a kapott ter-4 mék nagy pektintartalmú gyümölcslevek derítésére is alkalmas legyen. Jelen találmányi bejelentésünk tárgya eljárás fajlagosan észt erezett a-D-poligalakturonsav egy-5 ségeket tartalmazó pektinnel indukálható intra-és extracelluláris pektolitikus hatású enzimfehérje nagy térfogatban, alámerített, levegőztetett kultúrában történő előállítására Aspergillus alliaceus faj sejtjeinek segítségével, vala-10 mint a sejten kívül található enzimfehérje oldatból szilárd formában való kinyerése. A bejelentés tárgyát képező eljárásunkat az alábbi példákon szemléltetjük, melyek nem tekinthetők korlátozó jellegűeknek. 1. példa: 1200 liter csapvízben PT—1 jelű táptalajt készítettünk, melynek össztevői az alábbiak voltak: 20 búzakorpa 2 % (NH4 ) 2l S0 4 2 % KH2 P0 4 0,05% élesztőkivonat 0,25% szilikon MSA 0,1 % pH sterilezés előtt 3,8 HCl-val állítva. A táptalaj ezonkívül tartalmazott még 0,1% 30 a-D-poligalakturonsav egységekből álló pektinport, melynek észterezettségi fokát HOTTENROTH módszerével állapítottuk meg. Az a-D-poligalakturonsav karboxilcsoportjainak metilcsoporttal való észterezettsége 59%^os volt. 15 A táptalaj sterilezése 1,4 atü nyomáson, 60 percen át történt. A 28 C°-ra lehűtött táptalajt az Aspergillus alliaceus faj spóráival oltottuk be. A tenyészlevet 72 órán át óránként 100 m3 levegő befúvásával levegőztettük és szellőztet-40 tük, valamint 250 ford./perc fordulatszámmal lapátkeverővel kevertettük, 0,4 atü üzemi túlnyomás mellett. A keretes szűrőprésen szűrt tenyészlé pektolitikus aktivitását viszkózimetriás módszerrel 45 mértük. A szűrt tenyészlé aktivitása a tenyésztés 72. órájában 210 ASP egység volt literenként. A tenyészlé pH-ja ugyanakkor 3,01 volt. A mycéliumban feltárás után található enzimaktivitás 40 ASP egység volt kilogrammonként. 50 1000 liter szűrt tenyészlé pH-ját az elektromos pH-mérőn mért adatok figyelembevételével koncentrált H2S04-adagolással pH 3,00 értékre állítottuk be, és a szűrt levet 0C° — +1C° hőmérsékletre hűtöttük le. 55 Az így előkészített tenyészléhez 250 fordulat/ perc fordulatszámú lapátkeverővel való kevertetés mellett 600 kg ammóniumszulfátot adagoltunk úgy, hogy 100 kg ammóniumszulfát beadagolása után az oldat pH-ját elektromet-60 rikus pH-ellenőrzés mellett koncentrált H2 S04 hozzátöltésével pH 3,0 értékre állítottuk be. A 600 kg ammóniumszulfát beadagolását követően az oldatot 4 órán át tovább kevertettük, óránként ismételt pH ellenőrzéssel. Ameny-65 nyiben szükséges volt, az oldat pH-j'át koncent-2
