155148. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiszta ergotamin-típusú alkaloidokat stabilan termelő anyarozs törzsek előállítására

155148 egyértelmű összefüggés áll fenn, az ascospóraknák megfelelő, a küllem'beli különbségek fokozott kialakulását elősegítő táptalajon történő szélesztése gyakorlatilag jól hasznosítható lehetőséget nyújt a nagy ergotamm-termelőképességű törzsek szelekció útján történő kitenyésztésére. Így azt tapasztaltuk, hogy az ascospórák ammóniumszukcinátot (vagy más 4—6 szénatomos kétbázisú szerves sav ammóniumsóját) és szaharózt, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon való szélesztése útján nyert tenyészetek közül azok, amelyek 10—12 hetes korukban fehér színűek és vattás, vagy finoman ráncos, nyálkás felületűek voltak, a parazita tenyésztésben mindig tiszta ergotamintartalmúaknak bizonyultak. Emellett az említett táptalajon felületi tenyésztésben ezek a finoman ráncos, nyálkás típusú telepék feltűnő módon nagy alkoloidtartalmat mutattak, és ezt a kedvező termelőképességüket stabilan meg is tartják. Fenti felismeréseinken alapuló találmány tárgya tehát oly eljárás tiszta ergotamin-típusú alkoloidokat stabilan termelő, nagy alkoloidhozamú anyarozstörzsék előállítására, amelyet az jellemez, hogy a vegyes alkoloidtartalmú, pl. vadöntermő anyarozsból ivaros úton nyert ascospórákat cukrot, célszerűen szaharózt és kétbázisú, 4—6 szénatomos szerves sav, célszerűen borostyánkősav ammóniumsóját, továbbá ásványi sokat tartalmazó táptalajon szélesztjük, majd a kifejlődő óriás telepek közül alak és szín szerint kiválasztjuk azokat a fehér, előnyösen finoman ráncos, nyálkás felületű telepieket, amelyek fehér színüket a szobaihőifokon történő inkubáció során 10—12 hetes korban is megtartják. A találmány szerinti eljárásban a szelektálás céljából szélesztendő ascospórák ugyan bármilyen eredetű, pl. vadöntermő, vegyes összetételű és lehetőleg nagy alkoloid-tartalmú anyarozsból származhatnak, előnyösen azonban, ha a kiindulóanyagul választott vegyes alkoloidtartalmú anyarozsból először kiselejtezzük az ergotoxin-típusú alkoloidokat termelő törzseket. Ebből a célból a kiinduló vegyesen termelő anyarozsot először a fent említett korábbi RT—1289 sz. szab. bej. szerinti szelektálási eljárásnak vethetjük alá oly módon, hogy a pl. borsólisztes táptalajon tenyésztett micéliumokból kapott spóraszuszpenzióból kiszűrt apró (előnyösen 2—3 mikron hosszúságú és 1,5—2 mikron átmérőjű) spórákat, szénforrásként 4—6 értékű alkoholt, előnyösen mannitot és nitrogénforrásként aszparagint, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon szélesztjük, a lila színt mutató telepeket kiselejtezzük és a visszamaradó fehér telepeket parazita tenyésztésibe viszszük. Az így kapott anyarozsklerociumot használjuk azután fel ascospórák kinyerésére és a jelen találmány szerinti szelektálási eljárás lefolytatására. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példa szemlélteti: 1. példa: Kiindulóanyagként Claviceps purpurea (Fr.) Tul. fajú vegyes összetételű, ergotamint és ergotoxin-típusú alkoloidokat kb. egyenlő arányban tartalmazó, de nagy, kb. 0,45% összalkoloidtartalmú anyarozsot alkalmazunk. Ezt a 145 0,35 sz. korábbi szabadalmunk szerinti eljárással, 4% szaharózt, 1% sárgaborsó^lisztet, 1% 10 ammóniumszukcinátot, 0,1% káliumdihidrófoszfátot, 0,1% kalciumnitrátot, 0,03% krist. magnéziumszulfátot, 0,01% káliumkloridot és 2% ágár-ágárt tartalmazó, 5,6 pH értékű ferdeágár táptalajon szaporítjuk, majd a 4 hetes mieéli-15 umból készített spóraszuszpenzióban az apró (2—3x1,5—2 mikron méretű) spórákat steril körülmények között végzett szűréssel kb. 30%ra dúsítjuk és ezt a szuszpenziót steril vízzel 1 : 1000 arányiban hígítva 2%t

mannitot, 0,5% 0 aszparagint, 0,1% káliumdihidrofoszfátot, 0,025 % krist. magnéziumszulfátot, s 2% ágár-ágárt tartalmazó táptalajra szélesztjük. 4 hét múlva a lilás, vagy rózsaszínű telepeket eltávolítjuk, a megmaradó fehér színűekkel a szélesztést z0 még kétszer megismételjük és a végül megmaradó, rózsa-, vagy lilás színt nem mutató telepeket parazita tenyésztéshez oltóanyagként felhasználjuk. Az így nyert szkleróciumból aszkospórákat nyerünk. E célból a szkleróciumokat •TM ősszel vékony réteg földdel lefedve szabadba helyezzük úgy, hogy télen át a szkleróciumok a fagy hatásának ki legyenek téve. Tavasz beálltakor a szkleróciumokat a földből kiemeljük és célszerűen nedves moha közé helyezzük szoá5 balhőmérsékleten. Megfelelő nedvességről állandóan gondoskodva 2—3 hét múlva a szkleróciumok termőtestet hajtanak. Az érett termőtesteket a szklerőeiumról levágjuk és nyelüknél fogva tűre feltűzzük, majd a tűt Petri csésze 40 alsó és felső lapja közé helyezzük. A Petri csészében előzetesen kevés folyékony táptalajt helyezünk el, majd a Petri csésze felső lapja fölé lámpát teszünk, hogy a megfelelő hősugárzás folytán a termőtesteket az ascospórák kilovelé-45 sere bírjuk (25—30 C°). A kilövelt ascospórák számát a Petri csészében levő folyadékban megvizsgáljuk és a spóraszám szerint úgy hígítjuk a folyadékot, hogy 50 egy-egy KoUe-üveg leoltásához szükséges 1—2 ml oltóifolyadékba mintegy 4—6 ascospóra jus-55 A szélesztéshez a következő táptalajt használjuk: Szaibaróz • 100,0 g Borostyánkősav 10,0 g Kalciumnitrát 1,0 g Nátriumdihidrofoszfát 0,25 g 60 Magnéziumszulifát, 7 H2

0 0,35 g Kalciumklorid 0,12 g Csapvízzel 10O0 ml-re hígítjuk, ammóniumhidroxiddal közömbösítjük, 20 g ágár-ágárt 65 adunk hozzá és sterilizáljuk. 2