154494. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és egyszer az alfa-hidroxi-butirát-dehidrogenáz-aktivitás meghatározására
3 154494 4 tikai segédeszközök nélkül elvégezhető, ezért az alkalmazási lehetőségeket az orvosi gyakorlatban jelentékeny mértékben kiszélesíthetjük-A leírt vizsgálati módszer csekély ráfordítást igényel, így járványszűrővizsgálatoknál helyileg is alkalmazható és az ambuláns, valamint állandó diagnosztikában fontos módszerré válhat. A meghatározás egyszerűsége és gyorsasága lehetővé teszi, hogy nem begyakorlott személy is a HBDH aktivitás meghatározására alkalmas, az aktivitás meghatározása pedig súlyos betegségek diagnosztikájában elkerülhetetlenül szükséges feladat. Számos betegség lefolyásának ambuláns ellenőrzése ily módon kisebb laboratóriumokban is megvalósítható és így az orvosi diagnosztika fontos segédeszközévé válhat. A találmány szerinti módszernél főként a megbízhatóságot és a meghatározási pontosság hatszoros megnövekedését emeljük ki. Az alábbiakban vázolt kiviteli példák során a HBDH-meghatarozas lefolytatását, a vizsgálathoz használt vegyszer összetételét és alkalmazását szemléltetjük. 1. példa: Al'fa^hidroxibut'irát-dehidrogenáz-meghatározására alkalmas vegyszer összetétele: 1. oldat: 0,1 mólos foszfátpuffer (7,5 pH), 3,05 mg% P- a- diklórfenolindofenol, 9 X 10-4 nikotinamid-adeninindinukleotid, •5 X 10~3 alfa-hidroxibutirát. 2. oldat: 0,1 mólos foszfátpuffer (7,5 pH), 2,15 mg% P- a, diklórfenolindofenol, 9 X 10-4 nikotinamid^adenmindinukleotid. 3. oldat: 0,1% fenazinmetoszulfát. Az oldatokat külön-külön 0—5 C°-on sötét helyen több napon keresztül tárolhatjuk-2. példa: Szokásos hordozóanyagot, mint papírt vagy rostanyagot az 1. példa szerinti vegyszerekkel átitatunk és azt liofilizáló módszerrel szárítjuk. Az indikátor a 2. és 3. oldatban jelenlevő vegyszereket tartalmazza. 3. példa: A meghatározás kivitelezése során az 1. példa szerinti oldatokat az alábbi táblázatból kivehető arányban összekeverjük. A HBDH-meghatározáshoz alkalmas vegyszerkeverék összetétele: Próbacső 1. oldat 2. oldat 5 3. oldat 25 A 1,80 ml 0,04 ml 1,80 ml 0,04 ml A vizsgálandó anyagot egyidejűleg az A és B próbacsőbe adagoljuk és az oldatokat fotometriás, ill. vizuális úton összehasonlítjuk. Abból 10 a célból, hogy a redukálóanyagok enzimatikus befolyásából eredő hibát a mérési eredményeknél kiiküszöböljük, a mérést vakpróbával hasonlítjuk össze- .' • Az enzim-aktivitás mértékét úgy határozzuk 15 meg, hogy a vizsgálati anyag hozzáadása és a két próbacső, ill. az indikátorcsíkok színegyenlősége közötti időkülönbséget állapítjuk meg. A vakpróba és a vizsgált próba színkülönbségének megfelelő megválasztása útján egy megha-20 tározott tartományban az alfa-hidroxibutirát-dehidrogenáz kimutatási módszer pontossága az ismert módszerekhez képest hatszorosára növelhető. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás az a^hidroxibutirát-dehidrogenáz (HBDH) aktivitás meghatározására ember és állati szervezet extra- és ihtráeéllularis folya-30 dekában, azzal jellemezve, hogy a-hidroxibutirát-dehidrogenáz jelenlétében a nikotinamidadenindinukleotid (NAD) koenzim segítségével a-hidroxibutirátot onketobutiráttá oxidálunk és az így képződött NADH2 redukált koenzimet 35 fenazinmetoszulfáttal oxidálunk, végül pedig a redukált fenazinmetszulfát hidrogénjét a diklórfenolindofenol színezékre visszük át, így a színezék leukoformáját képezzük és az elszíntelenedést egyidejűleg az a-hidroxibutirát-dehidro-40 genáz aktivitás mérésére használjuk fel. 2. Vegyszer az 1. igénypont szerinti HBDH-aktivitás meghatározásához, azzal jellemezve, hogy nikotinamin-nadenindinukleotidból, diklórfenolindofenolból, fenazinmetoszulfátból, a-hidr-45 oxibutíirátból és foszfátpuffferból (pH = 6,8— 8,6) áll. 3. A 2. igénypont szerinti vegyszer reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a vegyszerek a megfelelő oldatokban a következő 50 koncentráoió tartományban vannak: 1. oldat: 1 mólos — 0,001 mólos foszfátpuffer, 10-2 —MP5 mólos nikotinamid-adenindinukleotid, diklórfenolindofenol, 10_1 —10~ 5 mólos -hidroxibutirát. 55 2. oldat: 1 mól — 0,001 mólos foszfátpuffer, 10~2 —1'0~ 5 mólos nikotinamid-adenindinukleotid, diklórfenolindofenol. 3. oldat: 0,001 %-^l% fenazinmetoszulfát. 4. Indikátorcsík HBDH-aktivitás meghatáro-60 zására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő hordozóanyag a 2. igénypont szerinti vegyszerekkel van átitatva-A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója. 6806937. Zrínyi (T) Nyomda, Budapest V., Balassi Bálint utca 21—23. 2
