154080. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum előállítására
154080 10 5. példa: A fermentációs eljárást az 1. és a 2. példában leírt módon folytaljuk le, és a máioéliumot forró amilalkohöltaan vagy ciklohexanolban extránál juk, majd az extráktuimot a nyers antibiotikum nyenése céljából betöményítjük. A végtermék aktivitásait a protozoaölő hatékonyság meghatározására szolgáló biológiai módszerrel 'határozzuk mleg, Tetrahymena pyriformis és Entamoeba histolytica, valamint Tetrahymena pyriformis felhasználásaival. Talajkivonat és földimogyoróliszt főzeten tartott Tetrahymeha pyriformis kultúrákat veszünk, majd standard Antiamoebin-anyagot veszünk, és 1 mg/ml vizes oldatot készítünk. Először antibiotikumot néhány csepp etanolban szolubilizáilni kell. A Tetrahymena mi-benként 2-104 cellát tartalmazó folyékony kultúráiból egyenlő mennyiséget viszünk csöviekbe, és sorozatos csőhígítási módszerrel 1 mikrogramm/ ml-től 100 mikrogram/ml-ig terjedő antibiotikum-koncentrációkat kapunk 1—10—20^-30— —40 stb. mikrogrammi/iml értékekkel. 1 órán át 24 C-on vlégzett alapos elegyítés és infcubálás után minden egyes cső oldatát mikroszkóp alatt megtviszgáljuk. Meghatározzuk azt a koncentrációt, amely mellett a sejtek 100%-a feloldódik. A következő sorozatiban azt a koncentrációt vesszük, amely mellett 10©%-os oldódást figyeltünk meg, valamint a következő alacsonyabb koncentrációt, és meghatározzuk 'a 60 perc alatt 100'% oldódást okozó legközelebbi koncentrációt. Tiszta Antiamoebin esetében az oldódási koncentráció 46—48 mífcrograram/ml. Összehasonlítási alap (antibiotikum nélkül) 1/100 mg/ml 1/200 mg/ml 1/300 mg/ml 1/400 mg/ml 10 15 20 25 30 35 Az E. histolytica (Hyman) laboratóriumban fenntartott törzseit használjuk. Az amőbálkat Balamutlh-féle teljesen folyékony közegben te- 40 nyésztjük, és a 37 C°-on inkubált 48-órás kultúrákat használjuk fel. Az amőbákat rizskeményítőt tartalmazó friss Balamuth-közeggel elegyítjük. Az aimőbák számlát ennél a hígítási eljárásnál úgy állítjuk be, hogy 0,0© ml-enként 45 közelítőleg 5 mozgásképes amőba legyen a fo-. lyadékban. Az Antiamoebin-olidatot hordozóként azonos közeget használva készítjük. Az antibiotikumot először néhány csepp etanolban szoiubilizálljufc. A titrfocitákat tartalmazó Ba- 50 lamiuth-közeget csövekben osztjuk el, és az antibiotikumot a kívánt végső koncentrációnak megfelelő mennyiségben mindegyikhez hozzáadjuk, majd a csöveket 37 C°-on 48 órán át inkubáljulk. Ezt követően mikroszkóp alatt le- 55 olvasásokat végzünk olyan módon, hogy meghatározzuk az aktív troffoeiták számát. 25-nlél több mozgékony trofoeita mezőnként 60 Teljes 'Oldódás, nincs amőba Ugyanaz Ugyanaz Ugyanaz 65 1/500 mg/ml 1/600—1/900 mg/mi 1/lOOQi mg/ml 1/20OO mg/ml 1/2500 mg/ml 1/5000 mg/ml Í/IOOOO mg/ml Ugyanaz Ugyanaz; 1/900 mg/ml koncentráció esetén egy vtagy ritkán két amőba Egy vagy két aktív, mozgékony amőba 0,05 ml-ben Ritka növekedés, egykét amőba per 0,05 anl 2—5 amőba per 0,05 ml Tíznél több amőba per 0,05 ml Tíznél több amőba per 0,05 ml A fenti adatok alapján megállapítható, hogy az Antiamoeibin amőbaölő hatékonysága 0,'5— —1,25 mikrogrammi/ml. Ugyanezzel az eljárással meghatározhatjuk ismeretlen minták aktivitását. Az antibiotikum orálisan adagolva nem toxikus, és egerek, patkányok, tengerimalacok, kutyák stb. jól tűrnek testsúlyfciiogwamrnonként 10 g-ot. Protozoák: és férgek által emberben és állatokban előidézett fertőzéseik gyógyítása esetén a terápiás dózis orális adagolásnál csupán 5 ing per testsúlylkilograrnm, ós a kezelés időtartama a teljes gyógyulásig rövidebb öt napnál. Az új antibiotikum terápiás hatása teháit kitűnő. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás az Antiamoebin elnevezésű új antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy az Emérieellopsis pbonensis, E. synnematicola vagy Cephalosporium pimprina törzsek levegőztetett vagy kevertetett kultúrált asszimilálható szénhidráit-, nitrogén- és szervetlen sóforrást tartalmazó tenyésztő táptalajban tenyésztjük, amíg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum nem termelődik, majd a táptalajból az alábbi tulajdonságokkal rendelkező antibiotikumot nyerjük ki: a) általános tulajdonságok: fehér, semleges polipeptid, tömbszerű tűkrisitályokkal; b) fizikai tulajdonságok: op.: 219—220 C°; optikai aktivitás: a25 D = + 10 (iC, 1,02% metanolban) «25 D = + 10 i(C, 1,03% dimetil-formamidban); utraibolya és infravörös elnyelés: 3320—3290 (kötött NH), 1050, 1530 (CO és NH deformáció), 1078, 695 cm-1; c) oldhatóság: az antibiotikum oldható metanolban, etanolban, butanolban, n-propanolban, izopropanolban, piridinlben, jégecletben, dimetilformamidban, vizes aoetonban, nedves metiletilketorihan és metil- és etilcellosztolvban; oldhatatlan vízben, kloroformban, éterben, petroléterben, etilacetátban, acetonban^ toluolban, széntetrakloridban, dioxáníban, benzolban, széndiszulfidban, Metilkloridban és etüénglikolban. 3
