153739. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubmerz Claviceps tenyészetek alkaloid termelésének fokozására

153739 3 4 tető morfológiát mutatnak. (Pl. Pharm. Ztg. 103, 1269, 1958, Proc. Roy. Soc. 155, 26, 1961.) Az összefüggés felismerése után többen igyekeztek a szklerociálishoz hasonló állapotot a szaprofita körülmények között mesterségesen is előidézni. A táplálkozási viszonyok változtatásával (Planta Med. 6, 404, 1958.) a kelátképző anyagok adagolásával (Phys. Plant. 17, 507, 1964.) és a növekedés gátlásával (Arch. Pharm. 292, 389, 1959.) sikerült ezideig felületi kultúrákban bizonyos hatást elérni. A növekedésgátlás módja az volt, hogy a felületi kultúrában kifejlődött Claviceps micéliumot a táptalajtól különválasztották és tápanyagot nem tartalmazó pufferoldatba helyezték. Az így előidézett „nyugalmi állapot" a szklerociális morfológia kialakulását elősegítette és egyben alkalmas volt alkaloid termeltetésére. Fokozta a képződő alkaloid mennyiségét, ha a nyugalmi állapotban levő micéliumhoz a közeg ozmózisos nyomását növelő mannitot vagy anorganikus sót adtak. (Die Pharm. 11, 570, 1961.) Munkánk során megállapítottuk, hogy szaprofita Claviceps kultúrát szklerociális jelleg felvételére fentiek közül leghatásosabban a környezet ozmózisos nyomásának növelésével lehet kényszeríteni. Felismertük azonban, hogy amennyiben a növelt ozmózisos nyomást nem a már kifejlődött micéliumra gyakoroljuk, azt ebből a célból nyugalmi állapotban napokon át tovább inkubálva, hanem a magas ozmózisos nyomást magában a tenyésztő táptalajban idézzük elő, az alkaloidtermelés nagyságrendi fokozását érhetjük el. Eljárásunk szerint tehát a magas ozmózisos nyomást a gomba szaporodásának kezdetétől a teljes növekedési idő alatt fenntartjuk. A magas ozmózisos nyomás tenyésztési idő alatti alkalmazását az a döntő felismerésünk tette lehetővé, hogy bármely Claviceps törzs ill. annak szaporítására használható bármely folyékony táptalaj esetében beállítható a táptalaj ozmózisos nyomása egy olyan optimális értékre, mely mellett az illető gomba szaporodása még nem gátolt, a tenyészet kifejlődik, de a kialakuló tenyészet ebben a közegben a szklerociális morfológia felvételére és ezzel fokozott alkaloidtermelésre kényszerül. A növelt ozmózisos nyomás tenyésztés közbeni alkalmazása azon túlmenően, hogy a fejlődő sejtek beforyásolásával lényegesen nagyobb alkaloidszint növelést idéz elő, további előnyökkel is jár az ismert, növekedés utáni, nyugalmi állapotú alkalmazással szemben, így nem szükséges a tenyésztési idő után újabb, hosszú inkubáció az alkaloidtermelésre, hanem az alkaloid a szaporodással egyidőben képződik; emellett nem szükséges a táptalaj levétele és helyette a magas ozmózisos nyomású pufferoldat adása, ami laboratóriumi jellegű művelet és üzemben, steril körülmények között csak költséges és bonyolult berendezésben lenne elvégezhető; végül a táptalaj ozmózisos nyomásának fokozásával alkaloidtermelésre serkenthető nemcsak felületi, hanem süllyesztett, tehát rázólombikos, vagy fermentációs Claviceps tenyészet is, ami lehetőséget ad ipari méretű alkaloidfermentáció hozamának növelésére. A találmány értelmében a növekedést és párhuzamos alkaloidtermelést befolyásoló hatást oly módon érjük el, hogy a rázott-tenyészet, laborméretű, vagy üzemi fermentáció táptalajához leoltás előtt a táptalaj ozmózisos nyomását 2—25 atm-val megnövelő, a gomba növekedésére nem toxikus adalékanyagot adunk, majd a táptalajt beoltva a tenyésztést a szokásos kevert, levegőztetett fermentációval folytatjuk. A tenyészet növekedésének megindulásától kezdve megfigyelhetjük, hogy az osztódás útján keletkező fiatal sejtek rövidesen a szklerociális formát veszik fel, ami makroszkópos megjelenésben azt a változást idézi elő, hogy a süllyesztett kultúra ismert vattaszerű miceilumtömege helyett göbös, aprócsomós növekedést kapunk, mikroszkópos képben pedig a fiatal osztódó hifasejteken kívül a tenyészet sejtjei rövidek, megvastagodottak és dúsan szemcsézettek. Az ozmózisos nyomás növelésére szolgáló adalékként szervetlen sók, mint a nátrium, kálium, kalcium, magnézium, klorid, szulfát, karbonát, foszfát sói, szerves savak, mint az acetát, szukcinát, aszparaginát nátrium, kálium, kalcium sói, vagy mono- és diszacharidok, mint a mannit, szorbit, glukóz, szacharóz alkalmazhatók. Szerves adalékok alkalmazása esetén figyelembe kell venni, hogy azok a gomba növekedésének idején metabolizálódnak, ezért az ozmózisos nyomás fenntartása érdekében ismételt adagolásuk szükséges. Ugyanscak ismételhető az anorganikus só adagolása a táptalaj metabolizálódó szerves komponensei csökkenő ozmózisos nyomásának kiegyenlítésére. Az egyszeri adagolás lehetősége, az egyéb anyagcserefolyamatok kisebbmérvű befolyásolása és gazdasági szempontok miatt legcélszerűbb ozmózisos nyomás fokozó adalékként anorganikus só, elsősorban nátriumklorid használata. A szokványos anyarozsalkaloid fermentációs táptalajok ozmózisos nyomása elsősorban a cukorkomponens értékétől függően 5—10 atm. körül van. Ez az rétek a tenyésztés ideje alatt a cukor felhasználása következtében esik. Az anorganikus sókomponensek által előidézett, a tenyésztés végéig gyakorlatilag állandónak vehető ozmózisos nyomás a szokványos anyarozs alkaloid fermentációknál 1 atm. alatt van. Az ozmózisos nyomást van t'Hoff törvénye RT alapján a P = — képlettel számoljuk, ahol R = 0,0821, T = abs. hő, V = az oldott anyag molekuláris koncentrációja. Elektrolit-oldatoknál figyelembe vesszük a disszociációt, 100%-os disszociációval számolva. Az ozmózisos nyomás 2—25 atm-val való nö-10 20 25 ?,0 35 4Q 45 50 55 60 2