152803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy eddig ismeretlen polipeptid előállítására
• 5 ' " b) H-Glu{OTB)-His~Phe-Arg-Try-Gly-<For)Lys-Pro-OH ~ 10 g CBO-His-Phe-(Tos)Arg-Try-Gly-(For)Lys-Pro-OH 5 liter száraz cseppfolyós ammó- 5 niával készített oldataihoz fém-nátrium darabokat adunk az oldat megmaradó kék színeződéséig. A reakeióélegyhez ezután ammóniuimkloridot adunk, az oldatot bepároljuk, a maradékot 0,2-n-eoeteavoldatfoan oldjuk, a 10 szervetlen sókat Dixon [Bioohem.Biophys. Acta, 34, 251 (1909)] módszere szerint eltávolítjuk, a sómentes oldatot bepároljuk, a maradékot metanolban oldjuk, és etiléter »hozzáadásával kicsapjuk. Ilymódon H-His-Phe-Arg- 1? -Try-Gly-(For)iLys-iPro-OiH-'monoacetátot (op. 180 CV[«]22D = —05° n-eoatisavoldatban) kapunk, amelyet 4 g CBO-GluíÖITBJ-OCP hozzáadásával 50 ml dimetiltformamidban oldunk. Az oldatot két napig hagyjuk szöbahőfokon 2fi állni, majd etilétert adunk hozzá és a levált terméket szűréssel elkülönítjük. Ilymódon 7,1 g CBO-Glu (OTB)-His-Plhe-Arg-Try-Gly- (For)Lys-Pro-OiH nyerhető; ezt 200 ml dimetilformamidban oldjuk és palládium-katalizátor je- 25 lenlétében hidrogénezzük. Szűrés és etiléterrel történő mosás után H-Glu(OTB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-(For)Ly:s-Pro-OH-aoetátot kapunk; op. 190 C°, [«]22 D = —19° (n-ecetsavoldatiban). 30 c) Tri^Ser-Tyr-^Ser-JNle-Glu(OTB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-(For)iLys-Pro-Val-Gly-(For)Lysz (For)iLys-Arg-Arg-Pro-OH 6 g H^lu(OTB)-His-Pfoe-Arg-Try-Gly-(For)- 35 Lys-Pro-OH-iacetétot ós 6 g Tri-Ser-Tyr-Ser-Nle4N3 -ot 50 ml dimetilformajmidiban oldunk, az oldatot 16 óra hosszat állni hagyjuk, majd bepároljuk és a maradékot forró etanolból kristályosítjuk. Ilymódon - 5,1 g Tri-íSer-Tyr- 40 -Ser-Nle-Glu(OTB)-His-Plhe-Arg-Try-Gly-(For)Lys-Pro-OH^acetátot (op. 220 C°, [a]22 D = -^23° dimetilformamidban) kapunk, ezt 50 ml dimetilformamidlban oldjuk és az oldatához T g trimetilecetsavat adunk. Az elegyet nagyvá- 45 kuuimíban eredeti térfogatának félére pároljuk be, majd —5 C° hőmérsékletre hűtjük le, azután 0,36 g trimetilacetilkloridot és 0,3 g trietilaminit adunk hozzá. 10 perc múlva 2,8 g H-Val-Gly-(For)L,ys-(For)Lys-Arg-Arg-Pro- 50 -O'H-aoetát és 0,3 ml trietilamin 200 ml dimetilformamiddal készített oldatát adjuk az elegyhez. 4 óra hosszat állni hagyjuk, azután aceton hozzáadásával lecsapjuk a terméket. Ilymódon Tri-Ser-Tyr-Ser-'NIe-Glu(OTB)-His- 55 -Phe-Arg-Try-Gly-(For)iLys-Pro-Vial-Gly-(For)Lys-(For)iLysMArg^Arg-Pro-OH-trimetilaoetátat kapunk, amelyet 50%-os vizes metanolban, kovasav-gélen át történő szűréssel tisztíthatunk tovább. 60 2. példa: 4 g Tri-Ser-TyrHSer-Nle-Glu(OTB)-His-Phe- Arg-Try-Gly- (For)iLys-Pro-Val-Gly- (For) Lys- 65 6 -(For)Lys-Arg-Arg-Pro-OIH 40 ml dimetilformamiddal készített oldatához 40 ml piridint és Q,6 g toluolszulfonsavat adunk, az elegyet nagyvákuumbain eredeti térfogatának felére pároljuk be, majd —5 C° hőmérsékletre 'hűtjük le és négy egyenérték H-Val-(For)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB és 1 g diciklohexil-karbodiimid oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet éjjelen át állni hagyjuk, majd aoetont adudk hozzá. A levált terméket szűréssel elkülönítjük, nagy vákuumban szárítjuk; ilymódon 4 g Tri-Ser-Tyr-Ser^Nle-Glu(OTB)-His-'Phe-Arg-Try-GÍy-(For)Lys-Pro-Val-Gly-(For>Lys-(For)Lys-Arg-A»g-Pro-Val-(For)Lys-Val-Tyr-,ProJOTB terméket kapunk, ezt oxigén kizárásával 3 liter 0,1 n sósavoldatban 3 óra hosszat hevítjük 100 C° hőmérsékleten. Ezután az elegyet vákuumban foepároljük, a maradékot acetonnal és etiléterrel mossuk és vákuumban megszárítjuk. Trifluorecetsav/szek.butanol/víz (1:120:160) rendszerben lefolytatott ellenáramú megosztás után 2,5— 3,0 g 'mennyiségű főfrafcciót kapunk, amely a kortikotropinéval egyező hatásosságot mutat és amely kromatografálás és elektroforézis során homogén anyagnak mutatkozik. Az anyag migrációja papír-elektroforézis esetén 5,8 pH-érték és 40 V/om mellett: 60 mm (az összehasonlításul alkalmazott hisztidin migrációja 70 mm). Migráció 1,9 pH-érték és 40 V/om mellett lefolytatott papírelektroforézis esetén: 93 mm (az összehasonlításul alkalmazott glutaminsav migrációja ugyanilyen körülmények között 81 mm). A fenti módon kapott polipeptid képlete H-Ser-Tyr^Se^Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-^Lys-Pro-Val-'GlyMLys-Lys-'ArgHArg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH. Ez a termék 110 C° hőmérsékleten 16 óra hosszat folytatott savas hidrolízis után az alábbi aminosav-összetételt mutatja: Ser2,9Tyr2 ,öNlei,iGluo,9Hisi,iPhe 1 ,o-Arg3,iGlyi,9Lys3,9Pro2,9Val3 ,i. Ezt a terméket vagy közvetlenül ebben az alakban, vagy valamely más sóvá átalakítva alkalmazhatjuk. A termék szilárd állapotban, oldatban vagy adszorlbátum alakjában tárolható. Szabadalmi igénypont: .-*• 1. Eljárás az eddig ismeretlen L-szeril-L-tirozil-L-szeril-aJ -norleucil-Ij-glutaimil-'L-'hisztidil-L-fenilalanil-L-arginil-iL-triptafanil-glicil-L-lizil-L-jprolil^L-valil-glicil-L-lizil-L-lizil-L-arginil-l-arginiljL-prolil-L-valil-L-lizil-L-valil-L-tirozil-L-prolin tetrakozapeptid előállítására azzal jellemezve, hogy a védett aminosavak vagy peptidek karboxilcsoportját akti-, váljuk, és peptidikötések kialakítása útján a fenti képletnek megfelelő védett tetrakozapeptidet állítunk elő, ebből a védőcsoportokat egy vagy több lépésben eltávolítjuk, és adott esetben az így kapott fenti képletű tetrakozapéptidet szervetlen vagy szerves savakkal önmagában ismert módon sóvá alakítjuk át. 3
