152446. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-klór 17-alfa-metil1,4-androsztadién-3-on-17-béta-ol mikrobiológiai előállítására
,£.;= t-*, >,«, -.'.i ,/•„ '.. • • • -fe-vß:*'w •'»•?:»•-•• ? . . .. . 10..- g NH4NO3 1 literre feltöltve csapyízzel. A tenyésztő táptalaj összetétele pl. a következő lehet: >-.•*••-. 0,05 g glukóz : 15,0 g pepton ; ....... 6,0[-., g kukoricalekvár, 1 literre feltöltve csapvízzel, pH. sterilezésv előtt 6,5. Az organizmusokat 25 C° és 37 C° közötti hőmérsékleten, előnyösen 28! Cc -on.tenyészthet-jük. A tenyészethez acetonbán vagy alkoholban oldva: "adagolhatjuk - áz ^átalakítandó szteroidot A 4-klór-metiltesztoszteron átalakulását papírkromatográfiás eljárással ellenőrizhetjük. A vizsgálat elvégzéséhez a fermentátumot megfelelő polaritású., organikus oldószerrel, pl.:, dir klóretánnal extrahálhatjuk. Az extraktumot bepároljuk, a bepárlási maradékot aceton-kloroform elegyben felvesszük, úgyhogy a koncentrátum szteroidtartalma 4 mg/ml körül legyen. Ebből az oldatból 50—100 - mikrolitert cseppentünk fel 30% propilénglikolt tartalmazó metilalkohollal impregnált, Macherey-Nagel 214-es papírra. A mozgó fázis széntetraklorid és metilciklohexán 1 :1 arányú, propilénglikollal telített elegye. Ebben a rendszerben a 4-klór-metiltésztoszteron 0,68 R/ értékkel, a 4-klór-nerobol 0,46 R/ értékkel fut. A kromatogramon a szteroid-foltokat ultraibolya kontakt fotózással, vagy antimonpentaklorid kloroformos oldatával hívhatjuk elő. A fermentáció végén a fermentációs folyadékot megfelelő polaritású szerves oldószerrel, pl. széntetraklpriddal, diklóretánnal, diklórmetánnal, kloroformmal, benzollal, etilacetáttal többször, kivonatoljuk,, a. kivonatokat egyesítés után szárítjuk, majd' szárazra; pároljuk. A száraz maradék néhány alkalommal közvetlenül kristályosítható, .más esetekben\ alumíniumoxidon végzett kromatografálás; után nyerhetjük kú a .deMdrogénezett terméket..,.. . .;•, ••%•.- • ',.• _; .A- találmány/szerinti' eljárás foganatosítására • az.^aiábfei.. kiviteli.;példákat;.adjuk,.;meg. „-;Khi 152446 jsmos. • *{JS ÍÍC 1. ,'Í-ÍJ-V-u>-í.,; ;|gf^^4^klórrl7ralfa-metil-l,4-androsztadién-17-béta^f^l-^i\^(47klórrdeltaTlTmetiltesztoszteron)i elő§£állítása: '-;••••• • :>ffl.í!w-^.-í .-. '.I-JAÍ ;••, Fusarium caucasicum 9 napos ferdeagar.!tenyészetéről, 5 ml steril vízzel készült szuszpenzió.;!— Izmirével oltottunk•• be '3X100 Richárd táptalajt 500.Í ml-es. Erlen-meyer lombikokban. A lombikokat. 200-as fordulatszámú, 2 cm-es kitérésű' síkrázóasztalon 28 C°-on inkubáltuk. 2 nap múlva ezekkel a tenyészetekkel oltottunk be 5 liter F jelű táptalajt üvegfermentorban. A fermentort 300-as fordulatszámmal kevertettük, percenként 5 1 levegőt bocsátottunk keresztül rajta és 28 C°-os vízfürdőben inkubál„ ^ tuk. A 24 órás tenyészethez adagoltunk 1 g ' f 4-klór-metiltesztoszteront '"50'' "nil ! äcetonban •' oldva. 'Äz adagolástól számított 4 óránként 50 ml •'mintát" vettünk a fermentátumból és azt - 5 - 2 X 12,5 - ml - - diklóretánnal extraháltuk. Az extraktumból 10 ml-t szárazra pároltunk és a bepárlási maradékot 1 ml aceton-kloroform elegyben feloldottuk. Ebből a koncentrátümból , . 50 ixl-t cseppentettünk fel pápírkromatográfiá-10 hoz.' Á ' 24.' órában' vett mintában kiindulási anyag már csak nyomokban' volt látható, ezzel szemben a delta-1-származék wfoltjaV % egyetlen átalakítási termékként volt kimutatható. Ekkor a fermentációs folyadékot háromszor 15. 1/5 térfogatú széntetrakloriddal; ( extraháltuk a micélium leszűrése után! Az ,extraktumot egyesítettük, vízmentes nátriumszuliáttal - szárítot• . tűk, majd vákuumban szárazra pároltuk. A száraz maradék éterből kristályosítható volt. Me-20 tanolos átkristályosítás után-a-kapott 4-klór-17--alf a-metil-1,4-androsztadién-l 7-béta-01-3-on op.-ja 130—135 C°, , (<*)D :. +58° (c =' 1, CHCI3 ,)A max MeOH: 247 mju.; log «.= 4,0. 25 2. példa: Alcaligenes faécalis K9—2 jelű törzs 3 napos, .burgonyás agar., .táptalajon,: Roux-palackban nőtt tenyészetét 100 ml steril vízben szuszpendáltuk. Ebből a szuszpenzióból 50 ml-rel oltottunk be 5 liter SA 5—g jelű táptalajt fermentorban. A tenyészetet 28 Cc -on percenként 300-as fordulatszámmal kevertettük és percenként 5 liter levegőt fúvattunk át rajta. 16 órával a beoltás után 50—50 ml tenyészetet steril körülmények között szétmértünk steril, 500. ml-es . Erlenmeyer-lombikokba, és 1—1. ml acetonban. oldva 10—10 mg; 44dórmetiltesztoszteront. adagoltunkí( a lombikokba. Ä-, lombikokat induláskor,12, 24,.36.és,48 óra;műlva*az 1. példában, leírt módon extraháltuk,..az extraktumot bepároltuk és a koncentrátiimot papírkrömatográfiásá. vizsgálatnak n yetett.ük^^alá % « A papírkromatpgrainicjJQl k3y^etóe«: ^uta^a^.z '45 idől>en,;:a£.47 ki ő^met^^ 30 35 40 voltí még .keyés-.ál^akulát^-j^kl^m^tesztor , ^zteroh^Eaen j^^as^^^íS^SMtS&SÍI-. ÍO, nem 1 volt • kimu|athaí^nií^íétó?ín' zb- vfcwdníí-fé •,A -.'- Szabadalmi igényponti e.SVB«lí?íí 55 Eljárás -4klór-17-alfa-metilrl,4-androsztadién-3-on-17-béta-ol előállítására, melyre jellemző, hogy. az / (I) • képletű " 4rklór717-alfa-metil-4--androsztén-3Hon-béta-ol-t! Alcaligenes faécalis K9—2.' vagy Fusarium caucasicum segítségével 60 alakítjuk át a (II) képletű 4-klórT17-alfa-metil-l,4-androsztadién-3-on-17-béta-0l-lá. .. 1 rajz, 2 képlet A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 658961. Zrínyi (T) Nyomda, Budapest V., Balassi Bálint utca 21—23.
