152001. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cianokobalamin-monokarbonsav oszlopkromatografiás elkülönítésére és sómentesítésére
152001 szeres, aktívszenes vagy ioncserélő rnűgyantás módszerek a mi esetünkben nem alkalmazhatók. Az oldószeres sómentesítésre alkalmazott fenol-kloroform elegy ugyanis hajlamos emulzióképzésre. A vizes közegből aktívszénre való adszorbeáltatással a sók a vizes oldatban maradnak ugyan, de a szénről a cianokobalamin-monokarbonsavak nem oldhatók le kvantitatíve, így ez a lépés nagy veszteséggel jár. Az ioncserés sómentesítés esetében az okoz nehézrséget, hogy a gyengén savanyú aktív anyag mellől el kell távolítani az előhívószer anionját. Bármilyen anioncserélőt Etlkalmazunk, az elválasztás nem kvantitatív, mert a cianokobalamin-monokarbonsavak egy része részben ionosán, részben adszorptív módon irreverzibilisen megkötődik az anioncserélő műgyantán. A találmány célja olyan eljárás biztosítása, amelynek segítségével az ismert előhívó oldatok hátrányai kiküszöbölhetők, és anioncserélő cellulózon végzett kromatografálás esetén a végtermék jó kitermeléssel, kellő tisztaságban, egyszerűen és gyorsan nyerhető ki. A találmány azon a felismerésen alapszik, hogy a cianokobalamin-monokarbonsavak anioncserélő cellulóz-oszlopon való elválasztásakor karbonát vagy hidrogénkarbonát-aniont tartalmazó előhívószert alkalmazva, a kromatografálással kapott, biológiailag hatásos anyag sómentesítése anioncserélő alkalmazása, ill. veszteség és az anyag károsodása nélkül megoldható. A találmány eljárás cianokobalamin-monokarbonsavak oszlopkromatográfiás elkülönítésére B12 -vitamin savanyú származékaitól, a kromagtografálandó vizes oldatnak anioncserélő cellulóz-oszlopra való felvitele, a B12 -vitamin vizes mosással való eltávolítása, az oszlopon maradt savanyú i2~vitami,n-származékoknak előhívószerrel végzett frakcionált leoldása és a kapott monokarbonsav-frakció sómentesítése útján, amely eljárás abban áll, hogy előhívószerként alkáli- és/vagy ammóniumkarbonátot és/vagy hidrogén-karbonátot tartalmazó vizes oldatot alkalmazzunk, és a sómentesítést csak kationcserélővel végezzük. Előhívószerként cégszerűen alkalmazhatunk 0,01—1,05 mólos, 7,0—9,5 pH-jú alkáli- és/vagy ammónium-karbonát-, ill. -hidrogén-karbonátoldatot. Igen kedvezőnek találtuk a 0,05—0,2 mólos, 9,2—9,5 pH-jú NaHC03—Na,CO :i vagy KHC03 —K 2 CO s pufferoldatot. A sómentesítést célszerűen úgy végezhetjük, hogy a kationt H+ ~ciklusban levő kationcserélővel eltávolítjuk, a karbonát-, ill. hidrogénkarbonát-tartalmú cianokobalamin-monokarbonsav oldatot pedig 20—40 Hg mm nyomáson 50—70 C°-on bepároljuk, a kristályosításhoz szükséges kis térfogatra, amikor is a karbonát- és a hidrogénkarbonát-ionok széndioxid alakban eltávoznak. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa: 10 g kristályos B12 -vitamint 0,1 n sósav-oldattal hidrolizálunk szobahőmérsékleten, 120 5 órán át. Ezután a klorid-ionok nagy részének eltávolítása céljából a hidrolizátumot OH-ciklusban levő Amberlite IR4B gyengebázisú anioncserélő oszlopon engedjük át. Az így kapott oldatot dietilaminoetil-cellulóz: (DEAE-cel-10 lulóz) oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot OH~~-ciklusban levő 30 g cellulózból vízzel készítjük, 5 cm átmérővel. A kromatografálandó oldatnak az oszlopon való átengedése után a B12 -vitamint vizes mosással távolítjuk el, majd 15 előhívószerként 0,1 mólos NaHC03 -oldatot alkalmazva, az oszlopról leoldjuk a monokarbonsavakat. A di- és trikarbonsavak, valamint az egyéb, nem identifikált savanyúbb bomlástermékek az oszlop tetején maradnak. Az így el-20 választott monokarbonsav-frakcióhoz 0,5 g/100 nil H+-ciklusban levő Amberlite IR120 gyantát keverünk, majd 10 perc keverés után az oldatot leszűrjük. A szüredéket 20—40 Hg mm nyomáson 50—70 C°-on 40 ml-re bepároljuk, szoba-25 hőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk, majd a kivált aktív monokarbonsav-kristályokat leszűrjük. Ilyen módon 2.1 g nyers cianokobalamin-monokarbonsav kristályt kapunk. 30 2. példa: Propionibacterium shermanii fermentálásával nyert, és a 149.538 sz. magyar szabadalom szerinti eljárással elkülönített aktív cianokobal-35 amin-monokarbonsav-tartalmú koncentrátumból a szennyezésként jelenlevő Bi2 - vitamint olyan módon távolítjuk el, hogy 50 1 fermentá'tumból 50 ml térfogatú koncentrátumot készítünk, és azt 2 g OH--ciklusban levő 40 ECTEOLA-cellulózból készült oszlopon engedjük át, majd az oszlopot vízzel mossuk. Ezután az aktív monokarbonsavat 0,05 mólos és 9,2 pH-jú NaHC03 —Na 3 C0 3 tartalmú pufferoldattal eluáljuk. Az így nyert cianokobalamin-monokarbon-45 sav frakcióhoz 0,4 g/100 ml H+-ciklusban levő DOWEX50 kationcserélő gyantát adunk, majd 10 perc keverés után a gyantát kiszűrjük, és az oldatot vákuumban 0,5 ml-re bepároljuk. Másnap a kivált kristályokat leszűrjük. Termelés 50 10,6 mg biológiailag aktív cianokobalamin-monokarbonsav kristály. 3. példa: 55 A Bja-vitamin gyártása során összegvűitött mellékfrakciók jelentős mennyiségű cianokobalamin-monokarbonsavat tartalmaznak di- és trikarbonsav-, inkomplett faktorok és kevés Bi,vitamin mellett. 100 ml ilyen oldatot, amely 60 elemzés szerint 875 mg cianokobalamin-monokarbonsavat tartalmaz, 25 g DEAE-cellulózból készült oszlopon kromatografálunk az 1. példában leírt módon. Az előhívást 0.05 mólos ammóniumkarbonát-oldattal végezzük. Az elvá-65 lasztott monokarbonsav-oldathoz 0,6 g/100 ml 2
