151621. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hirudin kinyerésére orvosi piócából

151621 5 6 sűrített oldat térfogatára számított tizenötszörös mennyiségű —10 C°-ra lehűtött acetonnal, majd centrifugálunk és az anyagot a centrifuga üvegbetétben jéghideg tiszta acetonnal szárazra mossuk. A terméket vákuumexikátorban utánszárítjuk. A hozam 9,0 g nyers hirudin. A termék specifikus aktivitása: kb. 500 ATE/ mg (antithrombin-egység). b) A nyers hirudin tisztítása 9 g nyers hirudint feloldunk 300 ml jéghideg desztilált vízben. 0° és 5 C° között nagyon lassú ütemben 540 ml 96%-os etanolt csurgatunk hozzá. A keveréket 30 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk, végül centrifugálunk. A felső folyadékréteg tartalmazza a hirudin fő részét, míg a csapadék az inaktív nagymolekulájú kísérőanyagokat, amelyek azonban a hirudin mintegy 30%-át adszorptíve visszatartják. Ezért ezt a csapadékot a fenti módon 300 ml jéghideg desztillált vízzel feloldjuk és ugyancsak fentiekhez hasonlóan 540 ml etanollal kicsapjuk. Az előzőhöz hasonló feldolgozási folyamatot harmadszor is elvégezzük a kicsapott csapadékkal. A feldolgozás után kapott maradékot most már eldobhatjuk és az extrakciós oldatokat az első szüredékkel egyesítjük. A hatóanyag kicsapására a teljes mennyiségű extrakciós oldatot 0° és 5 C° közötti hőmérsékletre lehűtjük. Ezután igen lassú ütemben mélyhűtött (—10 C°) etanolt folyatunk hozzá, míg az alkohol térfogatkoncentrációja 85% lesz. A kiflokullálás elősegítésére az alkoholhoz 0,5% ammóniumacetátot adunk. A képződött csapadékot, annak leülepedése után, centrifugálás útján nyerjük ki, és alkoholos mosás után vákuumexikkátorban megszárítjuk. A hozam: 3,12 g hirudin. A termék specifikus aktivitása 1300 ATE/mg. 3,12 g 1300 ATE/mg aktivitású hirudint feloldunk 4,6 pH értékű, 900 ml mennyiségű 0,01 mólos ammóniumacetát-pufferoldatban. Ebbe az oldatba 90 g finoman felaprított oxicellulózt viszünk be, (karboxiltartalma kb. 12%) és szobahőmérsékleten kb. 10 percig keverjük. Ezután egy fritten leszűrjük és az oxicellulózt három ízben 650 ml—650 ml desztillált vízzel mossuk. A mosóvizeket a szüredékkel egyesítjük. Az oxicellulózról a ráadszorbeált hirudint 0,05 mólos ammóniumacetátos pufferoldattal oldjuk le keverés közben, míg az eredeti erősen lecsökkent 4,5 pH értéket kapjuk. Az eluálásnál kapott oldatot is a szüredékhez öntjük. A hirudint tartalmazó oldatba 800 ml hidrogénformájú WOFATIT C.P. műgyantát viszünk be és egy éjjelen keresztül keverjük. Ez alatt a munkafolyamat alatt az oldat eredeti pH értéke 4,2-ről kb. 3,8-ra csökken. Ha az adszorpció sikerrel járt, amelyről a gyanta felett elhe- ' lyezkedő oldat vizsgálatával győződünk meg, a gyantát frittlapon kiszűrjük és háromízben egyenként 900 ml desztillált vízzel mossuk. A mosóvizeket és a szüredéket elöntjük. A gyantát 450 ml 1 mólos ammóniumacetát oldatban szuszpendáljuk és keverés közben 5%os ammóniaoldatot adunk hozzá cseppenként, míg a pH értéke 7,0-re emelkedik. Az így kapott szuszpenziót G4-es üvegfrittre visszük és leszívatjuk. Majd a gyantát még egyszer 450 ml 1 mólos ammóniumacetát oldatban szuszpendáljuk és 5%-os ammóniaoldat lassú hozzácsepegtetésével 8 pH értéket állítunk be. Ezt követőleg a gyantát ismét G4-es üvegfritten leszívatjuk és desztillált vízzel utánmossuk. Az eluáló oldatokat és a mosóvizeket egyesítjük és vákuumban 20—30 C° között 400—500 ml-re pároljuk be. A bepárlás után kapott hirudinoldatot a bepárolt térfogatra számított tízszeres térfogatú mélyhűtött (—10 C°) 95%-os etanollal kicsapjuk. Az etanolhoz kis mennyiségű, etanolban oldott 20 g ammóniumacetátot adunk. A keveréket pár óra hosszat mélyhűtőszekrényben tároljuk, majd a kivált tiszta hirudint lecentrifugáljuk. A terméket a centrifugaüvegben tiszta, jéghideg acetonnal szárazra mossuk és vákuum-exikkátorban megszárítjuk. A hozam 0,8 g tiszta hirudin. A termék specifikus aktivitása kb. 4500 ATE/ mg. 2. példa: 10 000 db orvosi piócafejet az 1. példában közölt előírás szerint extrahálunk. A nyers hirudin kicsapására azonban etánolt használunk fel, mimellett az 1. példában megadott koncentrációértékeket betartjuk. A további feldolgozási fázisok megegyeznek az 1. példában közöltekkel, azzal a különbséggel, hogy gyengén savas kationcserélő gyantaként Amberlite IRC—50-et alkalmazunk. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás hirudin kinyerésére orvosi piócából, az orvosi piócafejek alkoholos víztelenítésével és acetonos extrakciójával, azzal jellé-» mezve, hogy az erősen felhígított acetonos extrakciós oldatból a fehérje jellegű kísérőanyagokat gyengén savas közegből, míg a hatóanyagot az extrakció végén 6—7 pH értékre semlegesített, erősen koncentrált extrakciós oldatból, 1,5—2,5 pH értékre való megsavanyítása után, az extrakciós oldat acetonkoncentrációjának legalább 80%-ra való megemelése útján csapjuk ki és a kapott nyers terméket vízzel elegyedő szerves oldószerrel, célszerűen etanollal, egymást követő kicsapásnak vetjük alá, ezután ezt oxicellulózzal kezeljük, majd gyengén savas műgyanta bázisú kationcserélőn adszorpciót végzünk, végül a nagy tisztaságú hatóanyagot kinyerjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítás! módja, azzal jellemezve, hogy az oxicel-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3