151580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta4-3-keto-szteroidok előállítására mikrobiológiai úton
151580 melődik, a mikroorganizmus sötét, szürkésbarna oldódó pigmentet termel. Véres-agaron, 28 C°-on: jó növekedés, haemolysis. Lakmusz-tejen: 28 C°-on: lassan meginduló közepes erősségű növekedés koaguláció, gyenge peptonizálás, gyenge savanyodás. Zselatinon szúrási tenyészetben, 22 C°-on: közepes erősségű növekedés, elfolyósodás, barna, oldódó pigment termelődik. A Streptomyces K 451-es törzs, Pridham T. G. és Gottlieb P. módszerével mérve [J. Barct. 56, 107 (1948)] a következő szénhidrátokat fogyasztja jól: glükóz, fruktóz, inozit, maltóz, mannóz, trehalóz, nátriumszukcinát, nátriumacetát, keményítő. Gyenge növekedést biztosít: inulin, laktóz, mannit, szalicin. Növekedést nem biztosít: arabinóz, dulcit, galaktóz, raffinóz, rhamnóz, szaharóz, szorbit, szorbóz, xilóz. A Streptomyces K—451-es mikroorganizmust az alábbi táptalajokon tenyésztettük a mikrobiológiai átalakítás elvégzésére alkalmas biomassza nyerése céljából. D jelű táptalaj: 2% szójaliszt, 3% kereskedelmi glükóz, 0,2% kukoricalekvár, 0,1% kazamin hidrolizátum, 0,3% nátriumklorid, 0,5% kálciumkarbonát csapvízben, a táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7—7,l-re állítottuk. D3 jelű táptalaj: 2% szójaliszt, 3% keresk. glükóz, 0,5% kalciumkarbonát, csapvízben, a táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7—7,l-re állítottuk. A táptalajokat 100—100 ml-ként szétmértük 500 ml-es Erlenmeyer lombikokba és 121 C°-on 15 percig autoklávban sterilizáltuk. Az átalakítandó szteroidot valamely vízzel elegyedő oldószerben feloldva adagoltuk a tenyészethez és a tenyészetben az R anyag, a dioxipregnenolon, illetve az S vegyület koncentrációját kénsavas kromogén segítségével állapítottuk meg. A kromogénes analízist értékeltük, kvalitatív és kvantitatív papírkromatográfiás mérésekkel támasztottuk alá. Utóbbi esetben úgy jártunk el, hogy a fermentátumot pl. diklóretánnal extraháltuk, az extraktumot bepároltuk, a bepárlási maradékot aceton-kloroform elegyében feloldottuk, úgyhogy a koncentrátum szteroid tartalma 4 mg/ml szeroid koncentráció körüli érték legyen. Ezt cseppentettük fel 30%-os etilénglikol tartalmú metilalkohollal impregnált, előzetesen etilalkohollal túlfolyó kromatogram alakjában mosott Macherey—Nagel 214 jelű papírra, 50—100 mikroliter térfogatban. A mobil fázis széntetraklorid és diklóretán 1 : 1 arányú elegye volt, amelyet előzetesen etilénglikollal telítettünk. Ebben a rendszerben az R anyag közel az oldószer fronttal, az S vegyület 0,75 körüli, a dioxipregnenolon pedig 0,5 körüli R/ értékkel fut. A kromatogrammon lúgos trifeniltetrazolium-kloridos reagenssel hívtuk elő az anyagok foltjait, illetve ha a keletkezett Reichstein-féle S-vegyületet kvantitatíve kívántuk meghatározni, akkor ultraibolya kontakt fényképezéssel megállapítottuk ennek a A 4,3-ketocsoportot tartalmazó szteroidnak a helyét a papíron, a foltot tartalmazó papírrészt kivágtuk, a szteroidot eluáltuk 10 ml pro anal absz. etilalkohollal és az eluátum extinkcióját 242 mu-nál megmérve, a megfelelő vak-5 értéket levonva (szteroidmentes papírrészből készült eluátummal kapott érték) standard görbéről olvastuk le az oldat szteroid tartalmát. Találmányunk eljárás zl4 -3-keto szteroidok előállítására mikrobiológiai úton A5 -3 ^-oxi-10 szteroidokból oly módon, hogy az átalakítást Streptomyces K—451 jelzésű mikroorganizmus tenyészetével végezzük, vízzel nem elegyedő szerves oldószer vagy oldószerek jelenlétében. 3 vagy 21-helyzetben észter csoportot tartal-15 mázó szteroidok átalakítását Streptomyces K—451 jelzésű törzs előzetesen észter-csoportot tartalmazó zd4 -3-keto-sztéroid jelenlétében adaptáltatott tenyészetével végezzük. A vízzel nem elegyedő szerves oldószerből vagy oldószerek-20 bői csak a vizes tenyészet telítéséhez szükséges mennyiséget adagoljuk. Vízzel nem elegyedő szerves oldószerként célszerűen diklóretánt használunk. Eljárásunk kivitelezését az alábbi példák 25 szemléltetik: 1. példa: Streptomyces K—451-es törzs egy hetes bur-30 gonyás ferdeagar tenyészetéről 5 ml steril csapvízzel spóraszuszpenziót készítettünk. 1 ml ilyen spóraszuszpenzióval oltottunk be 2-szer 100 ml steril D-jelű táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikban. 48 órán át 28 C°-os ter-35 mosztát szobában 200-as fordulatszám, 2 cm kitérésű sikrázóasztalon inkubáltuk a lombikokat. Ezután a lombikokhoz 20—20 mg 17a 21-dioxipregnenolont adagoltunk 0,5 ml dioxánban feloldva. 24 és 48 órai fentiekkel azo*9 nos körülmények között kivitelezett inkubáció után a lombikokat 0,5 térf. diklóretánnal kiextraháltuk és az extraktumban meghatároztuk a Reichstein-féle S-vegyület mennyiségét. A 24 és 48 órás inkubálás után egyaránt 4,8 mg ^5 S-vegyület volt kimutatható, a dioxi-pregnenolon pedig teljesen eltűnt a tenyészetből. 2. példa: so Az 1. példában leírt módon előállított tenyészet 100—100 ml-éhez 16 mg 17a21-dioxipregnenolont adagoltunk és az egyik lombikhoz 100 ml diklóretánt adtunk a szteroid adagolással azonos időpontban. 4 órás rázatás után a kromogénes analízis szerint a diklóretánt is tartalmazó lombikban 99,6%-os volt a Reichstein-féle S-vegyület termelés, míg az oldószer nélküli tenyészetben 74%-os átalakítás volt mérhető. Dioxipregnolon egyik lombikban sem 60 volt kimutatható. 3. példa: Az 1. példában leírt módon előállított tenyé-65 szét 100—100 ml-éhez 16 mg 17«,21-dioxipreg-3
