151065. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a metanobaktériumos fermentáciű B12-vitaminhozamának növelésére
3 151065 4 Azt találtuk, hogy a fermentáció útján elérhető B12 -vitamin-koncentráció lényegesen emelkedik, ha a fermentációt bizonyos, eddig ilyen célra nem alkalmazott adalékanyagok jelenlétében folytatjuk le. Ilyen adalékanyagként a találmány értelmében glicint, borostyánkősavat és valamely A-koenzim készítményt (pl. nyers májkivonatot) alkalmazunk; előnyösnek bizonyult továbbá, ha ezek mellett még a fehérje lebontása útján nyerhető kismolekulájú peptideket is adunk a fermentációs közeghez. Ezek hozzáadása esetén a metanobaktériumos fermentációs közeg B12 -vitamin-koncentrációja 3,2—3,6 gamma/ml szintet ér el, tehát az eddig elért 0,3—0,6 gamma/ml termelés 5—10-szeresére növelhető. A B12 -vitamin termelésének ilyen váratlan nagymértékű fokozása specifikusan a felsorolt adalékanyagoknak tulajdonítható. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy sem a glicin egyéb aminosavakkal, pl. metioninnal, sem pedig a a borostyánkősav más hasonló szerkezetű szerves savakkal, pl. oxálsavval való helyettesítése esetén számottevő B12 -koncentráció-növekedést nem érünk el. A glicin és a borostyánkősav szerepének tisztázása céljából C14 -izotóppal jelzett glicinnel és borostyánkősavval is végeztünk fermentációs kísérleteket. Ezekből megállapítottuk, hogy a glicin jelzett karboxilszénatomja a fermentáció során nagyrészt gáz alakban (C02 és CH 4 ) távozik, egy része pedig a baktériumok fehérjéibe épül be. A borostyánkősav 2—3. metilcncsoportjának jelzett szene nem távozik el gáz alakban, hanem kis része beépül a keletkező B12 -vitamin molekulájába, részben pedig szintén beépül a baktériumok fehérjeanyagába is. - Ezek a tények azt mutatják, hogy a glicin és a borostyánkősav részt vesznek a baktériumok életfolyamataiban és ezáltal működnek közre a B12 -termelés fokozásában. A porfirin bioszintézisének vizsgálata során Shemin már utalt az A-koenzim szerepére a borostyánkősavnak és a glicinnek a porfirinvázba való beépülésével kapcsolatban. A porfirin és a korrin (B12 -vitamin) szerkezete között fennálló bizonyos analógia alapján feltehető, hogy a találmány szerinti eljárás esetében is ehhez hasonló mechanizmuson alapul az A-koenzimnek a B12 -vitamín termelését elősegítő hatása. A találmány szerinti eljárásban az A-koenzim bármely ismert A-koenzim-aktivitásu készítmény, pl. máikivonat alakjában alkalmazható. Kismolekulájú peptidkéat célszerűen tüdőfehérje enzimes lebontása, pl. pankreásszal történő emésztése útján nyert fehérje-hidrolizátum alkalmazható, használhatunk azonban erre a célra autolizált májat vagy tüdőt is. A találmány értelmében alkalmazásra kerülő adalékok a glicin, a borostyánkősav, az A-koenzim készítmény és a kismolekulájú peptidek az alábbi mennyiségű arányokban kerülhetnek alkalmazásra (1 liter fermentiere számítva): 0,06—0,1 g glicin, 0,06—0,1 g borostyánkősav, 2—10 ml A-koenzimként 10%-os szárazanyag tartalmú májkivonat, és kismolekulasúlyú pep-5 üdékként pedig 20—50 ml 30% szárazanyag tartalmú, pankreásszal emésztett tüdő. Példa: 10 10 literes üvegedénybe bemérünk 2000 ml nyers csatornaiszapot, 2000 ml inokulumot egy termelő fermentléből és 6000 ml csapvizet, majd a következő anyagokat adjuk hozzá: 10 g melasz, 1 g K2 HP0 4 , 1 g MgCl 2 , 30 mg 15 dimetilbenzimidazol, 100 mg Co(N03 ) 2 • 6H2 0, 30 g NH4HCO3, 10 g élesztő, 60 mg glicin, 60 mg borostyánkősav, 20 ml A-koenzim {10%os máj extraktum), 200 ml emésztett fehérje, 100 mg NaHC03 és 50 ml metilalkohol és 20 4 ml tömény ammóniumhidroxid. A fenti anyagok beadása után alaposan felkeverjük a férmentlevet, majd gumilappal lefedjük. Az üvegedényt 30—32 C°-os termosztátba helyezzük és naponta felkeverés után 25 50 ml metilalkoholt és 4 ml tömény ammóniumhidroxidot adunk bele. Az inkubációs idő 4—5 nap. Az inkubációs idő leteltével a fermentlevet feldolgozzuk, a B12 -vitamint papírkromatografálás után spektrofotometriásán 30 megmérjük. A keletkezett B12 35 000 gamma/10 liter fermentlé. Tehát a napi Bi2 termelés 700 gamma/liter-f érmen tlé. A találmány szerinti táptalajjal végzett metanobaktériumos fermentáció előnyei a követ-35 kezőkben foglalhatók össze az eddig leírt és alkalmazott eljárásokkal szemben: 1. Igen nagy, 3200—3600 gamma/liter B32 tartalmű fermentlé nyerhető rövid fermentációs idő alatt (4—5 nap); 40 2. olcsó és egyszerű tápanyagok kerülnek alkalmazásra; 3. a B12 -vitamin és az egyéb B 12 -származékok aránya 1 : 1 körül van, ami egyszerűsíti a feldolgozást; 45 4. a rövid fermentációs idő további kapacitás-növekedést jelent. Szabadalmi igénypontok: 50 1. Eljárás a metánobaktériumos fermentáció B12 -vitaminhozamának növelésére, azzal jellemezve, hogy az ismert összetételű fermentációs közeghez glicint, borostyánkősavat, valamely A-koenzim tartalmú készítményt, továbbá 55 adott esetben fehérje-lebontás útján nyert kismolekulasúlyú peptideket adunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, azzal, jellemezve, hogy a fermentációs léhez literenként 0,06—0,1 g glicint, 0,06—4),1 g 60 borostyánkősavat és 0,2—1,0 g szárazanyagtartalmú májkivonatot, továbbá adott esetben 5—20 g szárazanyagtartalmú fehérjehidrolizátumot adunk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója. 642569 Zrínyi (T) Nyomda, Budapest, V., Balassi Bálint utca 21—23. 2
