150979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 7-aminocephalosporán-sav N-acil-származékainak és rokonvegyületeinek előállítására
4 150.979 Mikroorganizmus Törzs Közeg Minimális gátló koncentráció mcg/ml Salmonella typhimurium — Salmonella meleagídis — Salmonella heidelberg — Shigella ílexneri - — Proteus vulgaris — Vibrio cholerae — Saccharomyces cerevisiae — Leptospira pomona — Leptospira icterohaemorrhagiae — Megjegyzés: a *) jelzésű Staphylococcus aureus koncentrációjú benzil 2. példa: 7-fenilacetamido-cephalosporánsav előállítása 2 g C-cephalosporin-nátriumsót 30 ml vízben oldunk, az oldat plí-értékét 2,5-re állítjuk be Dowex 50X8 (H*) hozzáadása útján, a gyantát leszűrjük és 10 ml vízzel mossuk, majd a mosóvízzel egyesített szüredékhez 10,2 ml n sósavoldatot adunk. Az oldatot 3 napig 20 C° hőmérsékleten tartjuk, majd 2,1 cm átmérőjű, 7 cm magas oszlopban elhetyezett acetát alakú Dowex—1 gyantára öntjük. A perkolátumot 5 ml-es frakciókban fogjuk fel (1—12. sz. frakció), majd az oszlopot vízzel eluáljuk mindaddig, míg összesen 34 frakciót nem fogunk fel. Ezután 0,5 n ecetsavoldattal folytatjuk az eluálást, további 66 frakciót gyűjtve ily módon' össze. Megmérjük minden egyes frakció optikai sűrűségét 260 millimíkron hullámhosszon. A 2—16. frakciókat egyesítjük. Az így kapott oldatot, amely a 7-aminocephalosporánsavat és a C-cephalosporin egyéb enyhe savas lebontási termékeit tartalmazza, semlegesítjük és nátriumhidrogénkarbonát-oldattal 7,0 pH-értékre tompítjuk CC>2-légkörben. Ezután a semleges "oldathoz lassan hozzáadunk a C-cephalosporin mennyiségére számítva 1,2 egyenértéknek megfelelő mennyiségű íenilacetilkloridot acetonban oldva, miközben az oldatot 0 C° hőmérsékleten tartjuk és annyi acetont keverünk a fenilacetilkloríd hozzáadása előtt az oldathoz, hogy annak végső aceton-koncentrációja (a fenilacetilkloríd acetonos oldatának hozzáadása után) 50% legyen. 1 óra elteltével az elegy pH-értékét 5,0-ra állítjuk be (üvegelektróddal ellenőrizve), majd az acetont vákuum alatt ledesztilláljuk. Utána a pH-értéket 2,0-ra csökkentjük és a 7-fenilacetamido-cephalosporánsavat, a jelenlevő N~fenilacetil-Cc -cephalosporinnal és N-íenílacetil-C-cephalosporinnal együtt butilacetátba extraháljuk át. A butilacetátot elkülönítjük és vízzel extraháljuk vissza, amelyet az egyensúlyi állapotban 5,0 pH-értékre állítottunk be alkáli hozzáadása útján. A vizes kivonatot liofilizáljuk. A kapott termék egy részét (150 meg) papíron kromatograf áljuk 4:1:5 térfogatarányú n-butanol-etanol-víz eleggyel, amikor is azt találjuk, hogy a termék három olyan alkotórészt tartalmaz, amelyek Staphylococcus aureus ellen hatásosak. A túlnyomó mennyiségben levő hatásos alkotórész 7-fenilacetamido - cephalosporánsav. A másik két hatásos alkotórész N-feniJacetil-Cc-eephalosporin és N-íenilacetil-C-cephalosporin; a buhúsleves 61 húsleves 122 húsleves 122 húsleves 122 húsleves 122 húsleves 1.5 húsleves -f- 2% glükóz 122 Korthof-féle tápoldat+10% szérum 20 Korthof-féle tápoldat+10% szérum 10 törzsek rezisztensek 200 mcg/ml-t meghaladó -penicillinnel szemben. tilacetát e két utolsó anyagot csak részben oldja ki. A 7-íenilacetílamido - cephalosporánsavat elválasztjuk a nyers keverék (17 egység/mg Staph, auureus ellen) másik két hatásos alkotórészétől; ez az elválasztás kromatográfia útján történik Grycksbo-féle papírtekercs-oszlopon (LKB-Produkter, svéd gyártmány), valamint ellenáramú megosztás útján. A papíroszlopról az eluálást vízzel telített n-butanollal végezzük. Egy előzetes kísérlet sorári a 7-fenilacetamido - cephalosporánsav nátriumsóját kaptuk a papíroszlopról, 167 egység/mg aktivitású por alakjában. Ez a termék természetesen távolról sem volt tiszta. Előzetes kísérleteket végeztünk az ellenáramú megosztásra is, kétféle oldószerrendszer alkalmazásával. Az első oldószerrendszer butilacetát és 1%-os ecetsav 1:1 térfogatarányú elegyéből állt (I. oldószer), a második oldószerrendszer pedig n-butanolból és 0,05 mólos nátriumfoszfát tompítóoldatból, amelynek pH-értéke 6,0 volt (II. oldószer). Miután nyolc átvitelt végeztünk az I. oldószerrel (10 ml felső réteggel és 20 ml alsó réteggel), a 7-fenilacetamido-cephalosporánsav koncentrációja a 6. és 7. kémcső között ért el maximális értéket, míg a többi hatásos alkotórész a 0. és 1. kémcsövekben volt található. Az 5., 6. és 7. kémcsövekből nyert anyag hatásossága kb. 50 egység/ /mg volt. Ennek az anyagnak a 4:5:1 térfogatarányú n-butanol-víz-etanol rendszerrel végzett papírkromatográfiai vizsgálata azt mutatta, hogy az egyedüli jelenlevő hatásos anyag 7-fenilacetamido-cephalosporánsav volt. A II. oldószerrel végzett 8 átvitel (20 ml mindegyik rétegben) után azt tapasztaltuk, hogy a nátrium-fenilacetamido - cephalosporanát a 3. és 4. kémcsövek között mutatott maximális koncentrációt, míg az egyéb aktív anyag főtömege a 0. kémcsőben maradt vissza. Kollidinacetát tompítóval 7,0 pH-értéken végzett eletkroforézis során a 7-fenilacetamido-cephalosporánsav kb. ugyanolyan sebességgel vándorolt az anód felé, mint a G-penicillin. Ha a fenilacetamido-cephalosporánsavat 37 C° hőmérsékleten inkubáltatjuk, a fenilacetamido-cephalosporánsav részlegesen egy CA-cephalosporin-Ípiridin) típusú aktív származékká alakul át. Ez a származék 7,0 pH-értéken végzett elektroforézis esetén semleges anyagként viselkedik. Ä 7-fenilacetamido-cephalűsporánsav (kb. 10 meg) nem válik lényeges mértékben inaktívvá, ha oly penicillináz-oldattal kezeljük, amely kb. tízszer
