150875. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5'-mononukleotidek előállítására
2 150.875 nyúltak azok a mag, csíra és/vagy csíraalkotórész extraktumok, amelyeket di- vagy monokotildeonokból, mint például leguminozákból, búzából, rizsből, árpából és/vagy füvekből, valamint a malátakészítésnél kapott úgynevezett korpa-csírákból állítottunk elő. A találmány körébe tartozik az is, ha nyers exraktumok helyett részben előtisztított exrakturnokat használunk fel. Az extraktumokat pl. frakcionált kalciumfoszfát gélfrakcionálással vagy acetonos vagy alkoholos kicsapással is előállíthatjuk. Általában célszerűnek mutatkozik, ha a kapott extraktumot kevés tisztítás után enzimben feldúsítjuk. A tisztításnál eljárhatunk pl. úgy is, hogy az enzimet a tiszta oldathoz adagolt kalciumfoszfátgélre abszorbeáltatjuk, majd centrifugálás után ammóniumszulfát- és foszfátpufferT oldattal eluáljuk és az oldatból metanollal, etanollal, acetonnal, vagy hasonló szerves oldószerekkel kicsapjuk. Ezt a lépést követő kromatografálással a még jelenlevő 5'-nukleotidázt is eltávolítjuk; ez az enzim ui. az 5'-mononukleotidekből foszforsavat hasít le. A mononukleotidek előállítása céljából az enzimextraktumot valamely nukleinsavtartalmú oldathoz vagy szuszpenzióhoz adagoljuk, és a keletkezett mononukleotideket, célszerűen földalkálisóik alakjában kicsapjuk. A nukleinsavak előzetes megtisztítására a találmány szerinti eljárásban nincsen szükség; nukleinsavtartalmú anyagként egyszerű élesztőextraktumokat is használhatunk. A kapott reakciótermék az adenin, guanin, uridin és citozin nukleotidjeinek elegye. Az egyes nukleotidek szétválasztását anioncserélőkkel végezzük. A találmány szerinti eljárással, a fent leírt módon, az adenin, guanin, citozin és timin dezoxiribohukleotidjei is előállíthatók, ha kiindulási anyagként dezoxiribonukleinsavat, illetőleg dezoxiribonukleinsavtartalmú nyersanyagot használunk fel. A találmány szerinti eljárás egy különösen előnyös foganatosítási módja szerint a nukleinsavak 5'-mononukletiddé való enzimatikus hasítására olyan növényi anyag extraktumokat használunk fel, amelyeket előzetesen rövid ideig tartó, esetleg nehézfémsók jelenlétében foganatosított hőkezelésnek vetettünk alá. Ezután a heterogén összetételű növényanyag extraktumokat, amelyeket adott esetben a nemkívánatos fertőzések elkerülésére vízben nehezen vagy egyáltalán nem oldódó szerves oldószerekkel, például toluollal és/vagy kloroformmal elegyítünk a nukleinsavak hasítására való felhasználásuk előtt, majd rövid ideig, körülbelül 5—40 percig, célszerűen IS—25 percig esetleg nehézfémsók jelenlétében 45 és 70 C" között, előnyösen 55—65 C° hőmérsékleten hőkezeljük. Különösen célszerű szervetlen sók, például a cink, nikkel és réz kloridjainak, szulfátjainak és nitrátjainak alkalmazása. A nehézfémsók töménysége az extraktumokban célszerűen 10~2 —10~ 5 mol. Meglepő módon azt találtuk, hogy ennél az eljárásnál a pH-érték tág határok között ingadozhat; természetesen erősen savas vagy lúgos pH-érték tartományok kivételével. Az 5! -mononukleotidáz nagymértékű inaktiválása céljából az extraktum 4 és 7 pH-értákek közé való beállítása különösképpen bevált. Adott esetben az eljárást pufferoldatok, például foszfát-, ftalát-, acetát-, vagy trisz- (oximetil)-aminometán puffer jelenlétében is végezhetjük. Ez utóbbi módon jelentős időmegtakarítást, valamint az S'-foszíor-dieszterázaktivítás lehető legnagyobb mértékű megtartását és egyidejűleg az 5-nukleotidáz legmesszebbmenő inaktivitását érhetjük el. Ezen túlmenően a találmány szerinti eljáráshoz kevés idegen anyag felhasználása szükséges. Ha nehézfémsó hozzáadása nélkül dolgozunk, akkor az 5'-nukleotidáz nagymértékű inaktiválására az extraktum 4—7 pH-értékre történő beállítása célszerű. Azt is találtuk továbbá, hogy a növényeket az extraháló folyamat során nem kell meghatározott pH-értékre beállított vizes oldattal kezelnünk. Az eljárást esetleg pufferoldatok, például foszfát-, ftalát-, acetát-, vagy trisz-(oxi-metil)-aminometán puffer jelenlétében is végezhetjük. A találmány szerinti eljárással előállított extraktumok önmagukban felhasználhatók a nukleinsavak hasítására. Az alábbi példák az eljárást közelebbről megvilágítják. 1. példa: 1 súlyrész spenótlevet (Spinacia eleraeea) fagyasztunk, majd felolvasztunk és 5 rész 7,5 pH-órtékű trisz-pufferoldattal [trisz~(oximetil)-aminometán puffer], amelyet a következőkben mindig ,,trisz-puffer"-nek nevezünk, és kevés toluollal elegyítjük és két óra hosszat keverjük. 2. példa: Egy súlyrész murokrépa gyökeret (Daucus carota) homogenizátorban toluol hozzáadása közben felaprítunk és ezt követően 5 rész, 7,5 pH-jú, trisz-pufferoldattal elegyítjük, majd három órai állás után, keverés közben centrifugáljuk. 3. példa: Burgonyagumókat (Solanum tuberosum) toluol hozzáadása közben 5 percig homogenizátorban felaprítunk és a kapott pépet ötszörös mennyiségű trisz-pufferoldattal (7,5 pH) és további toluolmenyiségek hozzáadása közben szuszpendálunk. Majd 5 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ezután keverés közben az oldhatatlan részt centrifugáljuk és az extraktumot a nukleinsav hasítására használjuk fel. 4. példa: Olaj mentesített lenmagot (Linum usitassimum) homogenizátorban 5 percig szétdörzsölünk, majd ezt követően tizenötszörös mennyiségű, 8,0 pH-értékű, trisz-pufferoldattal 2 óra hosszat szobahőmérsékleten kloroform hozzáadása közben (1%) keverjük. Ezután az elegyet centrifugáljuk és az extraktumot nukleinsav hasítására használjuk.
