150865. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy új antibiotikum előállítására
6 150.865 a táptalajt 27 C° hőmérsékletre lehűtjük; a végső térfogat ekkor 120 liter, a pH-érték 7,05. Ezután a táptalajt a Streptomyces 40 026 törzs rázott Erlenmeyer-palackban tenyésztett kultúrájának 250 ml-jével beoltjuk. A fermentorban levő kultúrát steril levegővel szellőztetjük, óránként 5 m3 levegő befúvatásával; a kultúra keverésére lapátos keverőt alkalmazunk, pareenlként 350 fordulattal. A hőmérsékletet 27 C°-o;n tartjuk. A táptalaj kezdeti 7,05 pH-éirtékét 10 óra hosszat tartja meg, azután lassan 6,9-re csökken, majd gyorsabban 7,5-ig emelkedik. A mioélium fejlődése a pH-érték e csökkenés során megy végbe; a kifejlődött kultúra 23 órával a beoltás után alkalmas a termelő fermentorba való átoltáara. A termelő kultúrát 350 literes fermentorban tenyésztjük; e fermentorba az alábbi anyagokat adagoljuk be: élesztőkivomat 2 kg cefre-sűrítmény 10 kg nátronlúg (fs. 1,33) 950 ml vízvezetéki víz, feltöltve 125 literre. A fenti táptalajt gőzbevezetés útján 122 C° .hőmérsékleten 40 percig sterilizáljuk. Sterilizálás után 25 C°-ra lehűtjük. A táptalaj teljes térfogata ekkor 150 liter. Ezután 50 liter steril vizes glükózoldatot adunk hozzá, 10 kg glükóztartalommal. A táptalaj végső térfogata tehát 200 liter, pH-értéke 6,85. A táptalajt a 170 literes fermentorban tenyésztett inokulum-kultúra 20 literjével oltjuk be. A közeget csavarszárnyas keverővel 545 percenkénti pordulatszámmal keverjük és óránként 10 m3 steril levegővel szellőztetjük, miközben a közeget 25 C° hőmérsékleten tartjuk. A közeg pH-értéke 40 óra alatt lassan 5,70-re csökken, majd 20 óira hosszat állandó marad, azután ismét emelkedik és a fermentáció kezdetétől számított 95 óra elteltével 6,95 értéket ér el. Az antibiotikum termelése akkoir kezdődik meg, amikor a pH-érték eléri az 5,70-et. A maximális antibiotikum termelés a pH-érték újbóli emelkedése során akkor tapasztalható, amikor a pH-érték 6,5-öt ér el. A fermentációt 95 ára eltelte után megszakítjuk. Ekkor a közeg antibiotikus aktivitása 410 mcg/ml. A fermentációs lé 190 literjét egy ikeverőművel felszerelt tartályba visszük át és 115 liter n-butanol hozzáadásával 1 óra hosszat keverjük, a pH^ártéket híg sósavval 3,5-re beállítva, majd 12 kg szűrési segédanyagot adunk a közeghez. Az elegyet szűirőprésem leszűrjük és a szűrőlepényt 50 liter vízzel mossuk. A szerves fázist ezután elkülönítjük, 11 liter vízzel mossuk, majd ismét elkülönítjük és a közeg eredeti térfogatának 1/20 részére, azaz 9,5 literre bepároljuk csökkentett nyomás alatt. Ehhez a koncentrátumhoz 28,5 liter hexánt adunk és kétszer extraháljuk, mindenkor 14,25 liter vízzel, a pH-értéket híg nátriumihidroxid-oldat segítségével 7-re beállítva. A vizes kivonatokat egyesítjük és csökkentett nyomás alatt az eredeti térfogat felére bepároljük, majd 3 pH-értéken kétszer extraháljuk 9,5 liter n-butanollal. A butanolos kivonatot egyesítve csökkentett nyomás alatt 1,4 liter térfogatra bepároljük, majd 11,2 liter petroléter hozzáadásával az antibiotikumot lecsapjuk. A csapadékot leszívatjuk, mossuk és megszárítjuk. Ily módon 115 g nyers terméket kapunk, amelynek antibiotikus aktivitása 325 mcg/mg. 100 g fenti módon kapott nyers terméket 3,3 liter vízben oldunk. Az oldatot 8 pH-értékre lúgosítjuk híg nátriumhidroxid-oldat segítségével, majd kétszer, egyenként 1,6 liter n-butanollal extraháljuk. A szerves oldószeres kivonatot egyesítjük, a pH-értéket híg sósavoldattal 5-re állítjuk be és 1,6 liter vízzel mossuk a szerves oldószeres oldatot, azután 30 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten, csökkantett nyomás alatt 0,16 liter térfogatra bepároljük. A tisztított antibiotikumot 1,6 liter dietiléter hozzáadásával lecsapjuk. A csapadékot leszívatva, mosva és megszárítva 38 g tisztított terméket kapunk, amelynek antibiotikus aktivitása 410 mcg/mg. 32 g fenti módon tisztított terméket feloldunk 1600 ml vízben. A pH-értéket híg sósavval 3,8-ra állítjuk be. Az oldatot azután 1600 ml, majd 800 ml 20 : 80 tf. arányú n-butanol — etilacetát eleggyel extraháljuk. A szerves oldószeres kivonatot egyesítjük és csökkentett nyomás alatt 320 ml térfogatra bepáiroljuk. 25 ml vizet adunk a bepárolt oldathoz és 48 óra hosszat 37 C° hőmérsékleten hagyjuk állni. Az így kapott kristályokat elkülönítjük, mossuk és szárítjuk. Ily módon 8,7 g terméket kapunk, amelynek az antibiotikus aktivitása 950 mcg/mg. 5 g fenti, nagyfokban tisztított terméket 30 ml dimetilformamidban oldunk, majd az oldatot leszűrjük. Lassan hozzáadunk 420 ml n-butanolt, aminek hatására a kristályosodás megindul. A kapott kristályokat elkülönítjük, mossuk és megszárítjuk. Ily móidon 2,9 g tiszta terméket kapunk, amelynek antibiotikus aktivitása 1000 mcg/mg. 2. példa: Egy 350 literes fermentorba az alábbi anyagokat visszük be: kukoricalekvár (50%-os száraz kivonat) 2 kg cefre-sűrítmény 10 kg nátronlúg (fs. 1,33) 1,2 liter vízvezetéki víz, feltöltve 125 literre. Ezt a táptalajt gőzbevezetés útján 40 percig sterilizáljuk 122 C° hőmérsékleten. Azután 25 C°^ra lehűtjük és hozzáadunk 50 liter steril vizes glükóz-oldatot, 10 kg glükóztartalommal. A közeg pH-értélke 6,95. Ezt a közeget azután a 170 literes fermentorban, a fentebb leírt módon kitenyésztett inokulum-kultúra 20 literjével beoltjuk (lásd 1. példa). A beoltott közeget csavarszárnyas keverővel, 440 percenkénti fordulattal keverjük és 25 C° hőmérsékleten tartva,, óránként 10 m3 steril levegővel szellőztetjük. A fenti műveletek sorám a közeg pH-értéke az 1. példában leírt módon változik. A fermentációt akkor szakítjuk meg, amikor a pH-érték újbóli emelkedése során eléri a 6,5 értéket, ami 69 óra múlva következik
