150833. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hirudin előállítására

2 150.833 karbamid, vagy guanidinklőrhidrát oldattal 0—70 C° közti hőmérsékleten 8,0—2,0 pH-határok között végezzük; alkalmazhatunk azonban a kivonáshoz sókeveréket és neutrális sók, valamint fehérje detergensek keverékét is. A 45—90 perces időtartamú extrakciót célszerűen hődenaturációval fejezzük be s az oldatlan maradék elkülönítése után a hirudint megfelelő adszorbensen, pl. derítőföldön megkötjük. Az adszorbció hőmérséklete 0—20 C°, pH-optimuma 3,9—1,0, időtartama 40—90 perc;' a szükséges abszorbens mennyisége 10—50 g/liter. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a kivonat elkülönítése után szervesoldószeres frakcionálási alkalmazunk pl. alkohollal, vagy acetonnal s a hirudint az így nyert csapadék vizes oldatából adszorbeáltatjuk, illetve adszorbció előtt tömény vizes oldatából a kísérő fehérjéket fehérjekicsapószerrel, pl. tanninnal kicsapjuk és eltávolítjuk. Az adszorbens kimosása után a hirudin leoldását vízzel, vagy vízzel elegyedő szerves oldószer és víz elegyével mérsékelten alkalikus vegyhatású közegben, 9,0—7,0 pH-tartományban 20—50 C° közti hőmérsékleten végezzük. Vízzel elegyedő szerves oldószerként alifás alkoholokat, pl. metil- vagy etilalkoholt, illetve acetont alkalmazunk 10°—70 térfogat% koncentrációban. Az adszorbensről leoldott hirudint az eluátumból a szerves oldószer koncentrációjának növelésével alacsony hőmérsékleten —-5 10 C° között kicsapjuk, elkülönítjük és rflegszárítjuk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy az eluátumból a szerves oldószert lepároljuk, a vizes oldatot megfagyasztjuk s a hirudint fagyasztott állapotból szárítjuk meg. Eljárásunk kivitelezését az alábbi példák szemléltetik. 3. példa: ' 1 kg fagyasztott állapotban tárolt piócát húsdarálón megdarálunk, majd 3!

liter 3%-os konyhasó oldatot adunk hozzá. Szobahőmérsékleten 60 percig" keverjük, ezután az oldatot 10%-os sósavval pH-2,0—2,5 határok közé megsavanyítjuk és 70 C°-ra melegítjük; 10—15 percig tartjuk ezen a hőmérsékleten, majd az oldatlan maradékot centrifugálással eltávolítjuk. A savanyú kivonat pH-ját állandó keverés közben 20%-os nátronlúggal 6,5—7,5 közé állítjuk be s a képződött csapadékot centrifugálással elkülönítjük. A sötétsárga színű hirudintartalmú fölöttes oldatot ezután desztillált vízzel háromszorosára hígítjuk, pH-ját 10%-os sósavval 2,0.—3,0 közé állítjuk be s állandó keverés közben literenként 10 g derítőföldet adunk hozzá; az adszorbció időtartama egy óra. Az adszorbenst előbb konyhasó oldattal, majd desztillált vízzel mossuk ki s centrifugálással vagy nuccson különítjük el. A hirudin leoldását 50 térfogat%-os vizes etilalkohollal 2 lépésben végezzük úgy, hogy az ammóniumhidroxiddal pH-8,0-ra meglúgosított oldószerből előbb 600, majd 300 ml-t használunk a leoldáshoz. Az egyesített eluátumból ezután az alkoholt ledesztilláljuk s a vizes oldat térfogatát 100—150 ml-re csökkentjük, pH-ját 1 n sósavval 4,5—5,0 közé állítjuk be, a képződött csapadékot elkülönítjük és eldobjuk. A sárga színű fölöttes oldatot ezután megfagyasztjuk és fagyasztott állapotból szárítjuk. A hozam: 0,55 g deszt. vízben jól oldódó 300 antitrombin egység/mg hatóértékű liofil termék. 2. példa: 1 kg fagyasztott állapotban tartott, majd megdarált piócát az 1. példában megadott eljárás szerint extrahálunk. A kivonat pH-ját 20%-os nátronlúggal neutrálisra állítjuk be és 1,5 térfogat etilalkoholt adunk hozzá keverés közben. A képződött csapadékot centrifugálással eltávolítjuk és eldobjuk, a fölöttes kivonatot vizes fázisra pároljuk vákuumban 30—40 C° közti belső hőmérsékleten úgy, hogy térfogata 7—800 ml legyen. Szobahőmérsékleten egyenlő térfogat acetont adunk hozzá, a képződött csapadékot elkülönítjük és eldobjuk, a fölöttes levet pedig 0 C°ra hűtjük. A lehűtött oldat pH-ját 2,0—3,0 közé állítjuk be s ötszörös térfogatú hűtött acetonnal csapjuk ki belőle a hirudint. Centrifugálás után a csapadékot 2—300 ml 1%-os triklórecetsavban oldjuk, az oldatlan részt nuccsoljuk, vagy centrifugálással eltávolítjuk; a világossárga fölöttes levet deszt. vízzel 1,0—1,5 literre hígítjuk és 20 g derítőföldet mérünk hozzá keverés közben. Egyórai kevertetés után az abszorbenst elkülönítjük és kimossuk. A hirudin leoldását 3—500 ml 45 térfogat%-os vizes acetonnal szobahőmérsékleten pH 8,0—8,5 határok között végezzük. Az aceton ledesztillálása után a vizes oldat térfogata 100 ml. Ennek pH-ját 1 n sósavval 4,5—5,0 közé állítjuk be s a képződött csapadékot elkülönítjük. A fölöttes hirudintartalmú vizes oldatot Seitz-szűrőn való szűrés után megfagyasztjuk és fagyasztott állapotból szárítjuk. A hozam 0,2 g deszt. vízben kitűnően oldódó 600 antitrombin egység/mg hatóértékű liofil termék. 3. példa: A 2. példa szerinti kivonással és alkoholos előfrakcionálással nyert hirudintartalmú oldatot vákuumban 300—400 ml-re sűrítjük be, majd szobahőmérsékleten 3 térfogatnyi acetont adunk hozzá: a rendszer 2 fázisa válik szét. Az alul elhelyezkedő hirudintartalmú fázist elkülönítjük, belőle az aceton nyomokat ledesztilláljuk, majd 0—10 C° közti hőmérsékletre hűtjük s térfogatának lemérése után keverés közben 1/10 térfogat 20%-os tannin-oldatot adunk hozzá. A keletkezett csapadékot nuccsoljuk és eldobjuk, az átszűrt oldat pll-ját triklórecetsavval 2,0—.3,0 közé állítjuk be, majd deszt. vízzel ötszörösére hígítjuk és belőle a hirudint a 2. példa szerint adszorbeáltatjuk, eluáljuk és izoláljuk. A hozam: 0,14 g 900 antitrombin egység/mg hatóértékű, deszt. vízben kitűnően oldódó liofil termék. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás hirudin előállítására, melyre jellemző, hogy a hirudint- fagyasztott és őrölt piócából vizes közegben neutrális sók, vagy fehérje detergensek, illetve ezek együttes jelenlétében kivonjuk, a kivonatból közvetlenül, vagy közbeiktatott