150782. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillánsav előállítására

2 150.782 többi termékeit is képes megkötni és így könynyebbé válik a 6-aminopenicillánsav elkülönítése a kevésbé szennyezett folyadékból. Különösen kedvező eredményeket kaptunk akkor, ha a kálciumfoszfát gélt nem előre készítettük és kevertük be a baktériumokat tartalmazó fermentlébe, hanem a csapadékot a fermentlében hoztuk létre. A tenyészethez dinátriumhidrofoszfát oldatot adtunk, a fermentlé pH-ját 6,5-re állítottuk, kálciumklorid vizes oldatát kevertük hozzá és lúgosítással (pH = 8) képeztük a gélt. Ilyen körülmények kőzött a gél baktériumkötő képessége fokozott és így kisebb mennyiségben kellett használnunk. Különös előnye ezen eljárásnak az, hogy a bontás nemcsak szakaszosan végezhető el a gélhez kötött baktériumokat a penicillin oldatba belekeverve, hanem folyamatos bontási lehetőséget is biztosít. Eljárhatunk úgy, hogy a baktériumtartalmú gélt oszlopba helyezzük és lassú áramban penicillin oldatot folyatunk át rajta. Eljárhatunk úgy is, hogy a jól ülepedő gélt folyadékba szuszpendáljuk és rendkívül lassú keverés közben az edény alsó részébe penicillin oldatot vezetünk. A felső részben elfolyó oldat gyakorlatilag 6-aminopenicillánsav oldatot tartalmaz. Eljárásunk tehát lehetővé teszi az Escherichia coli sejthez kötött enzimjével a sejtmasszának gélen történő megkötése révén a penicillin bontásával nagyüzemileg történő 6-aminopenicillánsav előállítását. Eljárásunk kivitelezését a következő példák szemléltetik: 1. példa: Escherichia coli (NY 1/3) törzset tenyésztettünk 5 liter hasznos térfogatú laboratóriumi fermentorban 28 C°-on a következő összetételű táptalajon: 0,1% kukoricalekvár, 0,1% pepton, 1% tripszinnel emésztett kazein, 0,18% dinátriumhidrofoszfát, 0,28% kálium dihidrofoszf át, 0,002%, szilikonolaj. Az oltás 20 ml 6 órás bouillon tenyészettel történt és a baktériumot 40 óráig tenyésztettük 25 C°-on. A tenyésztés befejezése után 200 g .10% szárazanyagtartalmú előre elkészített kálciumfoszfát gélt kevertünk a íermentléhez és 10 perces keverés után centrifugáltunk. (A gél készítése: 230 g trinátriumfoszfátot 5 liter vízben oldottunk. 110 g kalciumkloridot kevés vízben oldottunk és erős keverés közben a foszfátoldatba öntöttük. A pH-t ecetsavval 7,6-ra állítottuk. A keletkező gélt ötszörös térfogat desztillált vízzel három lépésban mostuk.) A kapott csapadékot kevés desztillált vízzel mostuk és 500 ml 1%-os, 8,0 pH-ra pufferolt G-penicíllin oldatban szuszpendáltuk. 20 óráig inkubáltuk 28 C°-on, szűréssel a csapadékot eltávolítottuk, majd négyszer újra szuszpendáltuk penicillin oldatban és az előbbihez hasonló módon inkubáltuk. Összesen 25 g penicillint tartalmazó oldatot használtunk, kaptunk 9.6 g 6-aminopenicillánsavat. A termelés 66%. 2. példa: • ! ' Az előző példával megegyező módon tenyésztettünk Escherichia coli-t. 40 órás tenyésztés után hozzáadtunk keverés közben 65 g dinátriumhidrogénfoszfátot 600 ml vízben oldva, amelynek pH-ját ecetsavval 6,5-re állítottuk. Ezután tovább folytatva a keverést, 33 g kalciumklorid oldatot adtunk vízben oldva és a pH-t 40%,-os nátriumhidroxiddal ?,8-re állítottuk. A kapott csapadékot, amely megkötötte a baktériumokat, szűrűn szűrtük, kevés vízzel mostuk, majd az 1. példához hasonlóan 1%-os G-penicillin oldat 500 ml-ében szuszpendáltuk (pH — 8), 20 órás inkubálás után 28 C°-on, a penicillin oldat nagy része 6-aminopenicillánsavvá bomlott, a csapadékot szűrtük és hasonló módon négyszer felhasználtuk. Összesen 25 g penicillint tartalmazó oldatot bontottunk el, kaptunk 10,6 g 6-aminopenicillánsavat: a termelés 73%. 3. példa: A 2. példához hasonló módon végzett fermentáció után a fermentációs folyadékhoz adagolt dinátriumhidrofoszfát és kalciumklorid segítségével gélt képeztünk, a baktériumokat megkötő gélt szűrtük, desztillált vízzel mostuk, majd 5O0 ml 1%-os G-penicillin oldatban szuszpendáltuk (pH-8) és az oldatot egy 5 cm átmérőjű csőbe helyeztük. 20 óra után alulról friss penicillin oldatot vezettünk be úgy, hogy 24 órán át 300 ml penicillin oldat (pH-8) folyt be. A bevitt penicillin oldat mennyiségének megfelelő oldatot felülről elvezettük, a kísérletet 7 napon át folytattuk. Összesen 2600 ml penicillin oldat bontását végeztük el, a beadagolt 26 g penicillinből 9,2 g 6-aminopenicillánsavat kaptunk. A termelés 51%. 4. példa: Az 1. példához hasonló módon 60 liter hasznos térfogatú fermentorban tenyésztettünk E. coli-t. 8 cm átmérőjű kromatografáló oszlopban 200 g nedves gélt, majd 8O0 g baktériumot tartalmazó gélt, majd ismét 200 g gélt helyeztünk el. Az oszlopon óránként 150 ml 1%-os G-penicillin oldatot szívattunk át. Az 5 napig tartó kísérletben összesen 180 g G-penicillint tartalmazó 18 liter oldatot szívattunk át, kaptunk 82 g 6-aminopenícillánsavat; termelés 78%-os. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás 6-aminopenicillánsav előállítására penicillin enzimatikus bontásával Escherichia coli törzs segítségével, melyre jellemző, hogy a bontást végző sejttömeget és enzimet gélre adszorbeáltatjuk s a vizes penicillin oldatban a bontást szakaszosan vagy folyamatosan végezzük, majd a keletkezett terméket önmagukban ismert módszerekkel elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy adszorbensként kalciumfoszfát gélt alkalmazunk és azt külön képezve adagoljuk be az Escherichia coli tenyészetébe vagy pedig a gélt magában a tenyészetben képezzük.