150246. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 17alfa-metil-17béta-hidroxi-androszta-1, 4-dién-3-on mikrobiológiai dehidrogénezéssel történő előállításának optimális kivitelezésére

2 150.246 tációs folyadékból mennyiségileg meg tudjuk határozni. A találmány értelmében a fermentációs folyadékból a fermentáció folyamán sűrű időközökben {különösen a maximális érték felé közeledve) mintát veszünk. A mintából a szteroidokat vízzel nem. elegyedő oldószerrel kirázással vonjuk ki. Kirázásra különösen klórozott szénhidrogének (pl. kloroform, szóntetraklorid, etilénklorid, triklóretilén stb.) alkalmasak, amelyek közül is kloroform használható igen előnyösen, minthogy az a kérdéses szteroidokat jól oldja és amieliett a fermentációs folyadék egyéb olyan anyagait, amelyek a későbbiek során a meghatározást zavarnák, csak elhanyagolható mennyiségben vonja ki. Az extrákéi óra a fentieken kívül alkalmazható még benzol, valamint a benzol alkil és halogén származékai (toluol, xilol, klórbenzol stb.). A fenti szíeroidtartalmú extraktuniban a dehidrometiltesztoszteron meghatározására színképző reagenssel reakciót hozunk létre. Reagensként erős savakat (-log K = 0,4—4) alkalmazunk (tfiklórecetsav, foszforsav, kénsav) tömény (70—100 g/g%) állapotban, ezek közül előnyösen 98 g/g%•os kénsavat, amellyel a színképzést a szteroidtartalmú oldattal szobahőmérsékleten történő rázatással végezzük. A két jelenlevő anyag (metlltesztoszteron és dehidrornetiltesztoszteroin) által adott színes termék szín intenzitása a kivitelezés körülményeitől nagyon függ. Ezért meg kellett keresni azon viszonyokat, amelyek a dehidrometiltesztoszteron mérésére legalkalmasabbak. A szín intenzitását a kénsav koncentráció meglepő módon oly mértékben befolyásolhatja, hogy míg a 96% esetén a dehidrometiltesztoszteron 16,2-szer erősebb színt ad, addig 85% kénsav koncentrációnál a metiltesz tószt erőn. színe kb. háromszor erősebb mint a dehidrometiltesztoszteroné. Hasonlóképpen változik a szín intenzitások aránya további tényezőkkel, mint pl. az össaerázás és a színleolvasás között eltelt idővel is. A színes reakcióterméket — amely a savas fázisba megy át — az oldószeres fázistól elválasztjuk, majd az oldószer nyomoktól gázátáramoltatáissal tisztítjuk meg. A színes oldat fényabszorpcióját a dehidrometiltesztoszteron színes termékére általunk jellemzett abszorpciós görbe maximumánál határozzuk meg, ahol az a koncentrációval arányban áll. Tömény kénsavas kromogén esetében ez 490—500 ma között van. Ismert tény, hogy az említett erős savak általában szerves anyagokkal, így szteroidokkal színeződést adnak. A biológiai oxidációnál alkalmazott táptalaj tartalmaz különböző szerves anyagokat, amelyek részint a táptalajban vannak oldva, részint a mikroorganizmusok anyagcseréje során keletkeznek. Meglepő módon az általunk megadott körülmények között ezek zavaró hatása teljesen kiküszöbölődik és a keletkezett szín csak a szteroid koncentrációjának a függvénye. A 'meghatározásban kapott értékeket a fermentációs idő függvényéiben célszerűen, grafikusan ábrázoljuk és amikor az így kapott görbe a maximumához közel tart (amikor az időegységre eső koncentrációemelkedés közei zéró), a fermentációs oxidációs folyamatot megszakítjuk. Példa: Az eredetileg 200 jug/ml metiltesztoszteront tartalmazó fermentációs folyadékból megfelelő időközökben (a fermentáció előrehaladtával kb. óránként) vett minta 10 mi-ét dugós centrifugacsőben 20 ml kloroformmal összerázzuk. Centrifugáiás után a kiextrahált fermentációs folyadékot eltávolítjuk, majcl a szerves oldószeres fázist vízmentes nátriumszülfáttal víztelenítjük. A szteroidtartalmú kloroformos oldat 10 ml-ét 10 ml 98 g/g%~~°s kénsavval választótölcsérben egy percig rázzuk. Kétperces várakozás után —• miközben a fázisok jól elválnak — a kénsavas fázist mosópalackba engedjük és 3 percig nitrogén átáramoítatással a szerves oldószer nyomokat kiűzzük. Öt perc állás után az oldat exíLnkcióját l = 500 m/xtiál spektrofotométerrel megmérjük. Az előre elkészített standard görbéről a fermentációs folyadékban jelenlevő dehidrometiltesztoszteron szint leolvasható. A különböző időpontokban vett minták dehidrometiltesztoszteron tartalmát az idő függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az így kapott görbéből extrapoláció segítségével a maximális termelési érték elérésének az ideje jó megközelítéssel meghatározható. Így pl. az 1. ábrán látható, hogy a 6. és 7. óra közötti idő alatt az értékemelkedés már igen kicsi. Ezért a 7. órai minta értékmeghatározása után (kb. 7,5 óra) a fermentációs oxidációs folyamatot leállítjuk. Ebben az esetben a maximumot nagy pontossággal értük el. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás 17ö-metil-17/?~hidroxi-androszta-l,4--dión-3-on (dehidrometiltesztoszteron) fermentációval történő előállításának optimális kivitelezésére, azzal jellemezve, hogy a fermentléből a szteroidot vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel kivonatoljuk, a szteroid elegy oldatában a dehidrornetiltesztoszteronra nézve specifikus színreakciót adó, a szerves oldószerrel nem elegyedő reagens-Bei reakciót hajtunk végre és a dehidrometiltesztoszteron tartalmat a keletkezett színes reagens fázis — célszerűen annak abszorpciós maximumán mért — extinkciójából kiszámítjuk, majd a fermentációs folyamatot optimális szinten megszakítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a fermentációs folyadék szteroidtartalmának kivon atolására szénhidrogéneket, klórozott szénhidrogéneket, előnyösen kloroformot használunk, 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy színképző reagensként erős savat (-log K = 0,4—4) .nagy koncentrációban, előnyösen 98 g/g%-os kénsavat alkalmazunk. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítás! módja, melyre jellemző, hogy a színes savas oldatból az optikai mérést zavaró