150194. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kombinált reagensek előállítására antistreptokinaze titráláshoz
150.194 hoz előbb 0,5 ml streptokinaze+fibrinogén oldatot mérünk és 15 percig 37 C° hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk, majd ehhez 0,5 ml plazminogén+trombin oldatot mérünk és 45 percig 37 C° vízfürdőben tartjuk. A 45 perc letelte után a csöveket egyenként kézbevéve megállapítjuk, hogy a fibrinalvadék elfolyóisodott-e? A szérumnak azt a legmagasabb hígítási fokát tekintjük a szérum antistreptokinaze titerének, amelyiknek a csövében miéig nem oldódott fel az alvadék, ugyanis ez a legmagasabb hígítás az, amely még elegendő antistreptokinaze ellenanyagot tartalmazott a streptokinaze enzym közömbösítéséhez. Hogy a titrálási eredmények összehasonlíthatóságát biztosítsuk, egy magas ASK titerű szérumot (vagy gammaglobulint) minden titráláshoz összehasonlító standardként állítunk be és amennyiben valamely titráláskor a standard értéke eltérne az elfogadott értéktől, akkor az eltérés mértéke arányában faktorral szorozva korrigáljuk a többi szérum eredményét is. A kombinált reagenseket a következőképp készítjük el: Veszünk bármilyen eredetű, bármilyen módezerrel készített streptokinazet, emberi plazminogént, marhafibrinogént és trombint. Azonosfajta oldószerben, lehetőleg foszfát-szalin pufferben (mely 0,1 mol KH2P0 4 tartalmú, pH 7,4-re állított fiziológiás NaCl oldat) mindegyik hatóanyagból külön-külön alapoldatot készítünk és mindegyik alapoldatot betitráljuk specifikus hatékonyságra, azaz megállapítjuk, hagy az alapoldatnak melyik az a legmagasabb hígítása, amely hígításból 0,25 ml 2,0 ml-es össztéríogatban még renr delkezik a neki tulajdonított specifikus hatással. Eljárásunk során — a szakirodalomban a négy hatóanyagra közölt különböző egységmér tekéktől függetlenül — azt a legkisebb hatóanyagmennyiséget tekintettük egy egységnyinek, amelyik még éppen kifejti a neki tulajdonított specifikus hatást, így pl. ha egy tromSbinoldatból 1:50 az a legmagasabb hígítás, amelyből 0,25 ml 2,0 ml-es össztérfogatban még képes megalvasztani a hozzáadott íihrinogént, akkor a csőben levő 0,25 ml trombin hatékonysága éppen egy egységnyi, következésképp az 1:50 hígítás hatékonysága milliliterenként 4 egységnyi, az alapoldalé pedig 4X50 = 200 egységnyi. Vagy ehhez hasonlóan, ha pl. egy plasminogen alapoldalból 1:75 az a legmagasabb hígítás, amelyből 0,25 ml aktiválva 2,0 ml össztérfogatú rendszerben még képes feloldani az egy egységnyi fibrinogénből és egy egységnyi trombinból alakult alvadékot, akkor a csőben levő 0,25 ml plazminogénhígítás hatékonysága egy egységnyi, következésképp az 1:75 hígításé ml-ként 4 egységnyi, az alapoldaté pedig 4X75 = 300 egység. Miután ily módon betitráltuk mind a négy alapoldalunkat, a streptokinazet keverjük a fibrinogénnel, vagy a trombinnal, a plazrninogént pedig a fennmaradóval, tehát vagy a trombinnal, vagy a fibrinogénnel. Az a fontos, hogy a fibri-A kiadásért felel: a Közgazdaság 630440. Terv Nyomda, Budapest ncgén és a trombin közül az egyik a streptokinazéhoz, a másik a plazmino génhez legyen hozzákeverve. A hatékonysági koncentrációkat illetően a következőképp kell eljárni: az összekeveredő két alapoldatnak egymással kb. azonos hatékonysági koncentrációjúnak kell lennie, a hatékonysági eltérés ne haladja meg a 100%-ot. Pl. egy 100 egységes streptokinaze alapoldat ana partes keverhető egy 50—200 egységes fibrinogen alapoldattal. Hatékonysági követelmény: a titráláshoz használandó mennyiség mindkét hatóanyagra nézve legalább 2 és: legfeljebb 8 egységnyi hatékonyságú legyen, A keverékoldat tehát legfeljebb olyan híg lehet, hogy a titráláshoz használandó mennyiségben mindkét komponensből legalább 2 egységet tartalmazzon, de természetesen célszerű ennél magasabb koncentrációban elkészíteni és csak a felhasználáskor hígítani a megfelelő mértékben. A nagy mennyiségben elkészített s a minimálisnál többszörös hatékonyságú kombinált reagensoldatokat ampullákba elosztva liofilezzük és így számos laboratóriumot hosszú időn át azonos készítménnyel láthatunk el. A vizsgáló laboratóriumok a titrálás megkezdésekor feloldják a két kombinált reagenst és csupán 0,5—0,5 ml-t kell bemérniök a vizsgálandó szérumhígításokhoz. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás kombinált antistreptokinaze reagensek előállítására és az ASK reakció kivitelére, melyre jellemző, hogy a fibrinolitikus reakrió elve alapján végzett lantistreptokinaze titráláshoz szükséges négy reagens: a streptokinaze, plazminogén, fibrinogen és trombin közül kettőt-kettőt (ASK reagens I. és ASK reagens II.) előzetesen megfelelő arányban, mégpedig az egységnyi hatékonyság ugyanannyiszor-töibbszcröK koncentrációjában összekeverünk, ampullákba elosztva liofilezünk, majd közvetlenül a felhasználás előtt feloldunk és az antistreptokinaze titert meghatározzuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy az ASK I. reagenst streptokinazeből és fibrinogénből, az ASK II. reagenst plazminogénből és trombinből készítjük. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy az ASK I. reagenst streptokinazeből és trombinból, az ASK II. reagenst plazminogénből és fibrinogénből készítjük. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy 1 ml vizsgálandó szérumhígitáshoz előbb az ASK I. reagens két lehetséges változata egyikének oldatából 0,5 ml-t mérünk, majd 15 perces inkubációs idő után. az ASK II. reagens két lehetséges változatának megfelelő oldatából mérünk 0,5 ml-t és 45 perc után megállapítjuk a tibrinolízis mértékét, amelyből a szérum antistreptokinaze titerét nyerjük. i és Jogi Könyvkiadó igazgatója V„ Balassi Bálint utca 21-23.
