149186. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tetraciklin előállítására
149.186 3 2. Szaharóz növekedés gyenge jó Czapek—Dox spóraképzés gyenge jó pigmentiképzés nincs nincs légmicélium szürkésfehér fehér 3. Burgonyanövekedés közepes-jó jó kivonatos spóraképzés közepes jó agar pigmentiképzés málnavörös-barna nincs légmicélium szürkésbarna fehér 4. Élesztőnövekedés jó gyenge kivonatos spóraképzés közepes gyenge glicerin pigmentiképzés nincs nincs légmicélium sárgásbarna sárga 5. Kukoricalekvár- növekedés jó gyenge glicerin spóraképzés jó gyenge pigmentiképzés nincs nincs légmicélium sárga sárgásfehér 6. Kukaricalekvár- összantibiotikum keményítő termelés E/ml 980 1850 NH4 N0 3 CaC0 3 tetraciklin % 3 91 Lényeges különbséget észleltünk az L. Sz. 536 és a CDSD—314 törzsek cukorbontási képessége között is: L. Sz. 536 CDSD—314 Vizsgált cukorféleség Glukóz + + Fruktóz + + Szaharóz + + Maltóz — + Mannóz + + Mannit — + Laktóz — + Galaktóz — + Xilóz — + • A vizsgált többi cukorféleséget (cellobióz, melezitóz, mamiitól, arabinóz, rafíinóz, dulcit, szorbit) egyik törzs sem bontotta. Az eredményeket összegezve megállapíthatjuk, hogy különlegesen alkalmazott és irányított mutagénsorozat behatással, melyet sajátos biokémiai módszerekkel kombináltunk, az eredeti Streptomyees aureoíaciens törzstől nagymértékben elütő mutánshoz jutottunk, amely a tetraciklin termelését magasabb szinten és 90% felett biztosítja. Az így fermentált tetraciklintartalmú íermentlé felhasználható minden további tisztítás nélkül állattakarmányozási célokra, melyhez célszerű a fermentált anyagot előzőleg besűríteni. Feldolgozható és tisztítható azonban az ismert tetraciklin kinyerési módszerek bármelyikével. Laboratóriumunkban is kidolgoztunk egy módszert tetraciklin tisztítására,' mellyel jó kitermeléssel igen tiszta tetraciklin állítható elő. Ennek lényege, hogy a micéliumtól «avasán megszűrt fermentlevet megfelelő lúgosítás mellett (pH 8—9) kvaterner ammónium bázis, ill. só típusú vegyülettel 'kezeljük, a kicsapódott tetraciklin kvaternersót szűrés és mosás után, vizes közegben, savval elbontjuk. A szűrletfoől a tetraciklínt a fölös vases kalcium-ionok lekötése, ill. eltávolítása után szerves oldószerrel, célszerűen n^butanollal extraháljuk. A butanolos kivonatból a tetraciklínt újbóli extrakcióval ismét vizes fázisba visszük át (savas közegben). Az extrakció hatásfokát 0,05%-ban alkalmazott vas Ili-sókkal 95% fölé emelhetjük. A vizes kivonatot részlegesen bepárolva a tetraciklin hidrát kikristályosodik. Igen előnyösnek találtuk az anyag minősége és a hozam növelése céljából, hogy a bepárlás. ill. kristályosítás előtti oldatot valamely bórhidriddel, célszerűen nátrium bórhidriddel kezeljük. A kapott tetraciklin hidrát gyógyászati célokra kiválóan alkalmas és a gyógyszerkönyvi előírásoknak mindenben megfelel. Kívánt esetben akár a kristályosítás előtti oldatból, akár a tetraciklin hidráiból tetszés szerinti tetraciklinsó készíthető, a megfelelő sav, ill. bázis felhasználásával. Példák: 1. A CDSD—314 törzs mínusz 10 C°-on fagyasztva tárolt spóra szuszpenziójából 1 ml-el (spóraszám 107 nagyságrendben), beoltunk 100 ml inokulum táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikban és excenteres rázóasztalon 48 órán át tenyésztjük. Az inokulum táptalaj összetétele 2% keményítő, 2% kukoricalekvár (szárazanyagira számolva), 0,4% CaCOa. 0,2% pálmaolaj. A pH sterilezés után 6,6—6,8, hőfok 25 C°. Rázási sebesség 220 r/min, A kifejlődött oltóanyagból 2 ml-el beoltunk 100 rnl fermentációs táptalajt 500 ml-es Erlenmeyer lombikban, s rázóasztalon 96 órát tenyésztjük 25 C°-on. A fermentációs táptalaj összetétele 2,5% keményítő, 0,6% kukoricalekvár (szárazanyagra számolva) 0,5% NH4NO3, 0,4% CaC03) 0,2% KNO3, 0,3% pálmaolaj. Sterilezés után a pH 6,1—6,3. A fermentációs folyadékból értékmeghatározást a 40. órától végeztünk. 40h 64h 88h Antibiotikumtartalom E/ml 1260 1852 1820 Tetraciklin % — 91,5 90,5 A tetraciklin-klórteíraciklm arány meghatározására a f érmen tléből egy a laboratóriumunkban kidolgozott kvantitatív papírkromatográfiás eljárást használtunk. A módszer hibahatára nem haladta meg a + 5%-ot. A íermentléből a tetraciklínt a 4-es példában leírtak szerint nyerhetjük ki.
