149041. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a B12 vitaminnak mikroorganizmustenyészetekből való feltárására
2 149.041 vagy centrif ugatással) elkülönített sejt-tömeget (bio-massza) formaldehid jelenlétében hőkezelésnek vetünk alá. Célszerűen 40%-os formaldehidoldatot alkalmazunk a feltárandó térfogatra számítva 0,1—5,0% mennyiségben. Kiindulási anyagként mikroorganizmus tenyészeteket pl. sugárgomba tenyészeteket alkalmazhatunk. Eljárásunk egy előnyös foganatosííási módjánál a Propioni bacterium tenyészetekből indulunk ki. if Kísérleteink során összehasonlításokat végeztünk a cianid-ionok, a szulfit-ionok és a formaldehid stabilizáló hatása "között és a formaldehid ilyen irányú hatását találtuk a legerősebbnek. A formaldehid hatásimechanizimusa e tekintetben még nem tisztázott. Feltehető, hogy a hőkezelés folyamán a szabaddá váló kobalaminokból és a formaldehidből olyan átmeneti komplex alakul ki, amely a hőkezelésnél a kobalaminoknak ezt ;iz eddigi stabilizálószereknél nagyobb stabilitását biztosítja. A feldolgozás során azután ez a kohalamin-formaldehid kötés elbomlik, mert az így kezelt feltárt oldat kristályos termékké továbbfeldolgozva,, az semimilyen mérhető tulajdoimságában sem különbözik a kristályos B12 vitamintól. A feltárás folyamán a peptid-kötésből szabaddá váló koibalamin-féleségek továbbfeldolgozása különböző ismert módokon történhet. így például különböző szerves oldószerekkel történő egymásutáni •íkivomatolas .után alumínium oxidon való kiromatogirafálással, majd tömény vizes oldatból aceton hozzáadásával való kristályosítással. A feldolgozás valamely későbbi, kisebb térfogatú és könnyebben kezelhető fokán cianid-io•nokkal való kezeléssel a kobalaminokat természetesen át kell alakítani cianokobalaminná. Ez a feldolgozás későbbi fokán szükséges átalakítás a feltárásnál formaldehiddel stabilizált oldatok esetében ismert módon elvégezhető. Az eljárás részletei a példákban találhatók. 1. példa: 2% szójalisztet, 2% keményítőt és 0,5% kalciumkarbonátot tartalmazó táptalajon készült 120 órás levegőztetett 2,0 y/ml Bj2 vitamin tartalmú Streptoniyoes olivaceus tenyészet 30 literét három egyenlő részre osztjuk. Az első 10 literes részlethez keverés közben 20 ml 40%-os formaldehidoldatot adunk, a második 10 literes részletben 15 g nátriumcianidot és a harmadik 10 literes részletben 20 g mátriumhidrogónisziulfitot oldunk fel. A három oldatot a továbbiakban egymással párhuzamosan, teljesen azonos módon dolgozzuk fel. Az oldatokat 15 perc állás után 1 órán át 100 C°-on tartjuk. Az így kezelt fermentációs oldatokból a micéliumot szűréssel eltávolítjuk, majd a szűredéfcből a vitamint 50—50 g fuller-földön megkötjük. A fullerföldet centrifugatással kinyerjük és arról 500 ml 67 térfogafeziázialékcs vizes alkohollal a Bi2 vitamint leoldjuk. Az így nyert oldatokból az alkoholt lepároljuk. A lepárlás után 150 ml vizes B]2 vitamin-oldatot nyerünk. Ebben 0,45 g nátriumcianidot oldunk fel és 1 órán át állni hagyjuk. Az oldatból a vitamint 3x15 ml benzilalkohollal kivonatoljuk. Az egyesített benzilalkoholos oldatokból 25 ml kloroform hozzáadása után 3x10 ,ml vízzel a vitamint kivonatoljuk. Az egyesített vizes oldatokból 3 x 5 ml fenol^kloroform 1 :4 eleggyel kivonatoljuk a Bi2 vitamint. Az egyesített fenolkloroformos fázisokat 2 x 4,5 ml 10%-os foszforsav-oldattal, majd ugyanolyan térfogatú desztillált vízzel mossuk. A mosott fenol-kloroformos vitamin-oldatot Brockmann alumíniumoxid kromatografáló oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízmentes acetonnal átmossuk, majd a vitamint 10 ml 1:2 arányú vizes acetonnal leoldjuk és ehhez az oldathoz 25 ml vízmentes acetorit adva, a vitamint kristályosítjuk. Kitermelés: a feltárás előtt formaldehiddel stabilizált fermentációs oldatból 9,8 mg, az egyébként azonosan kezelt, de a feltárásnál cianid-ionokkal stabilizált fermentációs oldatból 9,0 mg és az egyébként azonosan kezelt, de a feltárásnál szulfit-ionokkal stabilizált fermentációs oldatból 8,8 mg kristályos B[2 vitamin. 2. példa: Propionibacterium shermanii-tenyészetből centrifugál ássál az élő baktériumtömeget tartalmazó sűrítményt készítünk. A nedves sűrítmény B12 vitamin-tartalma grammonként 160,3 y. A homogén sűrítmény 100—100 grammját (16,03 mg B12 vitamin) 2001—200 ml vízben szuszpendáljuk. Az első részlethez 2 ml 40%-os formaldehid-oldatot, a másodikhoz 2 g nátriuímcianidot, a harmadikhoz 2 g nátriumhidrogénszulfitot adunk. Keverés és 15 perc állás után az elegyeket 20 percig 120 C°on tartjuk. Az így feltárt szuszpenziókat a továbbiakban teljesen azonos módon lehűtjük és centrifugáljuk, majd az üledéket 80—80 ml vízzel átmossuk és ismét centrifugáljuk. Ezt az átmosást és centrifugálást 80—80 ml vízzel megismételve és a mosóvizeket az oldatok főtömegével egyesítve 400—400 ml vizes oldatokat kapunk, melyeknek B12 vitamin tartalma a formaldehiddel stabilizált szuszpenzió esetén 39,7 y/ml (15,88 mg Bi2 vitamin), a nátriumcianiddal stabilizált szuszpenzió esetén 36,8 y/ml (14,72 mg Bi2 vitamin) és a nátriumhidrogénszulfittal stabilizált szuszpenzió esetén 35,5 y/ml (14,20 mg Bi2 vitamin). 3. példa: Propionibacterium shermannii-tenyészetből centrifugálással az élő baktériumtömeget tartalmazó homogén sűrítményt készítünk. A nedves sűrítmény BI2 vitamin-tartalma 148,8 y/g. A sűrítmény 10—10 kg-os mennyiségét (1,488 g B|2 vitamin) 20—20 liter vízben felszuszpendáljuk. Az első szuszpenzióhoz 200 ml 40%-os formaldehid-oldatot, a másodikhoz 200 g nátriumcianidot, a harmadikhoz 200 g nátriumhidrogénszulfitot adunk. 15 perc kevertetés után az elegyeket 1 órán át 100 C°-on tartjuk. Az így feltárt szuszpenziókat a továbbiakban teljesen azonos módon kezeljük. Lehűtés és centrifugálás után a csapadékát 8—8 liter vízzel átmossuk és újíból centrifugáljuk. Ezt az átmosást és centrifugálást újabb 8—8 liter vízzel megismételve, 40—40 liter térfogatú vizes oldatokat kapuink, melyeknek Bi2 vitamintartalma a formaldehiddel stabilizált szuszpenziónál 36,1 y/ml (1,444 g Bj2 vitamin), a nátriumcianiddal
