148961. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új bázikus jellegű antibiotikum előállítására
2 148.961 Lakmusz-tej: a törzsek egy része savat termel, peptonizál. (28 C°.) Plotho táptalaj: jól nő, levegőmicélium fehéres, halvány barnás oldódó pigment. (28 C°.) Egyszerű gelatina: szúrási tenyészetben néhány nap múlva mérsékelt folyósítás, barnás, oldódó pigment. (20—22 C°.) Húsleves-gelatina: szúrási tenyészetben mérsékelt folyósítás, barnás, oldódó pigmentet termel. (20—22 C°.) Nitrátredukció: lassan indul, később erőteljes. {28 C°.) Haemolysis: kisfokú. (28 C°.) Dextroset, laevuloset és salicint savképzéssel erjeszti (peptonvíz). (28 C°). D-tartarot-ot bontja. (28 C°.) Saccharoset, lactoset, mannitot, maltozét, mannozét, arabinozét, galaktozét, rhamnozét, raffinozét, trehalozét, dulcitot, inazitot,. szorbitot, szorbozét, adonitot, inulin nem erjeszti (peptonvíz 28 C°), ezekben a táptalajokban sárgásr-barna oldódó pigmentet képez. A törzs által termelt antibiotikum bázikus jellegű, katíoncserélő gyantán kötődik, amelyről savval leoldható. Vízben, metanolban, formamidban jól oldódik, oldatából aceton, éter, benzol, etil és magasabb alkoholok kicsapják. Az antibiotikum termelése a Streptomyces törzs süllyesztett -aerob tenyésztésével történik steril körülmények között, az antibiotikumok előállítására használatos készülékekkel. így pl. a termelés történhet úgy, hogy burgonyás ferde-agaron tenyésztjük a Streptomyces törzset, a keletkező spórákat víz segítségével lemossuk és a kapott ispóraszuszpenzióval beoltjuk az 500 ml-es Erlenmeyerlombikban levő 200 ml steril és megfelelő összetételű táptalajt. Az Erlenrneyer-lombikot 28 C°-on termosztát szobában levő rázógépre helyezzük. A fermentáció 80—130 óráig tart, de eljárhatunk úgy is, hogy az antibiotikum iparban használatos „többlépcsős tenyésztési módszert" használjuk. A spóra-szuszpenzióval beoltott, 6 óráig rázatott tenyészetekkel 100 liter hasznos térfogatból a megfelelő összetételű steril táptalajt tartalmazó inokulum fermentort oltunk és 48 óráig 28 C°-on levegőzetve és keverve folytatjuk a tenyésztést, majd ezzel oltunk 1000 literes hasznos térfogatból és ugyancsak megfelelő steril táptalajt tartalmazó fermentort. A tenyésztést 60—120 óráig folytatjuk keverés és levegőztetés közben. A táptalaj tartalmazhat nitrogénforrásként szójalisztet, amerikai mogyoróiisztet, kukoricalekvárt, élesztőt, peptont, kazeint. Energiaforrásként glükózt, keményítőt, szaccharózt, laktózt és glicerint, továbbá anorganikus sókat a növekedés elősegítésére és a táptalaj pH-jának állandósítására. A habzás megakadályozása olaj segítségével történik. A legmegfelelőbb táptalaj tartalmaz: szójalisztet 2,0% keményítőt 2,5% NaCl 0,3% KHPO4 0,1% CaC03 0,5% pálmaolaj 0,5% koncentrációban. pH sterilezés után 7-es. A táptalaj készítése csapvízzel történik. Az ismertetendő kísérletek eredménysi önkényesen felvett biológiai egységekkel történnek. Az antibiotikus hatású anyagok meghatározása pH 8-as húsleves peptonos agáron folyt lyukasztott petri csészében, agardif fúziós módszerrel, lényegében a sztreptomycin meghatározásával egyező módon. 1 E-nek neveztük azon antibiotikus hatást, amely 10 mm 0-jű lyukasztóval előkészített agaros petri csészében B. subtilis ATCC 66—33. törzsön 22 mm-es gátlási gyűrűt ad. Természetesen mivel ezen gátlási érték naponta ingadozott, már a kísérletek kezdetén egy nyers koncentrált preparátumot használtunk standardként eredményeink állandósítására. 1. példa: A táptalaj összetétele: 2,0% szójaliszt, 2,5% keményítő, 0,3% NaCl, 0,1% KHPO4, • 0,5% CaCOr^ 0,5%, pálniaolaj. 500 ml-es Erlenmayer-lombikban 200 ml táptalajt 30 percig 121 C°-on sterilizáltunk. A táptalajt lehűtése után ferdeagar tenyészetről lemosott spóraszuszpenzió 1 ml-ével (104 spóra) rázógépre helyeztük el 28°-os termosztát szobában. A rázógép 280-as fordulatot tesz percenként 2 cm kör 0 mellett. Kapott termelési érték 120 E/ml. 2. példa: Termelés kísérleti üzemi levegőztetett fermentorban. Az inokulum és fermentor táptalaj összetétele ugyanaz, mint az 1. példában. Spóraszuszpenzióval oltottunk az 1. példában megadott módon 10 rázótenyészetet, 60 órás korában steril körülmények között egy oltóedénybe szívattuk és ezzel oltottunk 100 liter hasznos térfogatú inokulum fermentort, melynek sterilizálása 30 percig 121°on történt keverés közben, direktgőz .bevezetéssel. 48 óráig tenyésztettünk e készülékben, mely készülék 250 fordulatú turbo-keverővel van ellátva. A tenyésztés alatt percenként 100 liter steril levegővel levegőztettünk. Ezután átoltottuk az 1000 literes fermentorba, melynek kezelése az előbbivel teljesen megegyezett és a 80. órában 83 E/ml-es termelést kaptunk. £ A szilárd oxálsavval pH 2 értékre savanyított oldatot megszűrtük, a micéliumot a szűrőn 50 1 vízzel kimostuk, majd centrifugáltuk. A szűrt mosóoldat aktivitása 52 E/ml. Ioncserélő oszlopban 4,5 1 Amberlit IRC 50 gyantát töltöttünk be H ciklusban. A fermentlevet 12 l/óra sebességgel folyattuk át az ágyon, a lefolyó oldat átlagos aktivitása 10,5 E/cm3 . Megkötődött a fentiek szerint 71 000 000 E. A gyantát kimostuk 20 1 desztillált vízzel, majd 15 1 0,04 n HCl-el. Az oszlopot n HCl-el eluálva a második litertől kezdve 3000 E/cm3 fölötti aktivitás mérhető, a kilencedik liter után az aktivitás élesen leesik. A legnagyobb
