148776. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heparin tartalmú kivonat előállítására állati szervekből

2 148.776 Kiküszöböljük azonkívül a ki vonat óláéiban az eddigi módszereknél általaiban alkalmazott ammoniumszulfát- és általaiban minden szulfáttartalmú reagens használatát is, mert tapasztalataink szerint a későbbi tisztítási folyamatokban a szulfát-iomok ill. a Na2SC>4 állandóan kísérő szenynyeződés; ugyanis a tisztítási lépcsők végén történő alkoholos., vagy acetonos kicsapódások a hepar imnal együtt az alkáliiszulfátot is kicsapják. Ettől a szennyeződéstől csak egy külön tisztítási lépés, — dialízis vagy elektrodialízis árán lehet megszabadulni, amit valamennyi eddig ismeretes eljárás alkalmaz is. További célja a jelen találmánynak, hogy az általában 16—24 óráig proteolízis, ill. autolízis idejét lerövidítve, a feltáró berendezésnek nagyobb kapacitásit tudjon biztosi tani. Az is célunk, hogy kiküszöböljük a bosszú ideig tartó, 35—45 C°-om végzett hőkezelés következtében, még toluol jeleinlétében is fellépő rendkívül bűzös folyamatot, mely főképp állott szervek feldolgozása esetén igen kellemetlen munkakörülményéket okoz. Kísérleteink során széles körben megvizsgáltuk, hogy milyen lehetőséig van enzimek kiküszöbölésével, tisztán kémiai feltárásra. Eközben az eddigi szakirodalom véleményével ellentétes meglepő és a gyakorlat számára igen előnyös felfedezést tettünk. Az irodalom szerint ugyanis előnyösebbnek látszik a lúgos kivonatolást anaerob körülmények között, oxigén kizárása mellett végezni. (A. B. Foster és A. J. Huggard, The Chemistry of Heparin, Advances in Cairbohidrat Chemistry, "Vol. 10., 346. oldal.) Ezzel szemben mi azt a megállapítást tettük, hogy a levegő kizárása mellett, vagy redukáló közegben végzett lúgos kezelés alacsonyabb hatóértékű kivonatot szolgáltatott, mint ha az egyéb kísérleti körülmények megfelelő megválasztása mellett a lúgos kivonatolást oxidáló környezetben., célszerűen peroxidok mellett és levegőztetés közben végezzük. Ez utóbbi módszernél rövid idő alatt igen magas hatóanyag tartalmú extrakt léhez jutunk. Sorozat-kísérletekben megállapítottuk azt is, hogy a kivonatoláshoz szükséges elektrolit-koncentrációt biztosítani lehet a teljes térfogatra számított 2,5—6% NaCl hozzáadásával, az optimális pH 8—11 között van, és a kivonatoláshoz elég egy óráig tartó 60—65 C°-os hőkezelés. Az elegy fielfoirralásával előidézett koaguláltatás és szűrés után a szűr let heparin tartalma sósavval megsavanyítva dús fehérjecsapadékkal együtt leválik. A módszer igen magas nyeredéket szolgáltat hosszú ideig, vagy szakszerűtlenül tárolt tüdőiből, vagy lépből, májból és izomszövetből is, így pl. elérhető 1 kg marhatüdőből 25—35000 ME tartalmú kivonat. A peroxid alkalmazása az esetleges bűzös szagot azonnal megszünteti, és előnyösen fertőtlenít és színtelenít is, és mivel az egyetlen jelenlevő elektrolit a konyhasó, ill. sósav, olyan nyerstermékhez jutottunk, amiből a fehérje eltávolítása után egy lépésben gyógyászati tisztaságú, magas egységszámú heparin állítható elő. Az alábbi példában bemutatjuk a találmány alkalmazását, amikor mint legolcsóbb kereskedelmi terméket, hidrogénperoxidot használunk feltáró reagensként, de természetesen alkalmazható bármilyen más peroxid kötést tartalmazó vegyület,. mint Na-peroxid, vagy Na-perborát, stb. Példa: 80 kg, hűtőházban — 5 C°-on tárolt marhatüdőt felolvadása után 8 mm lyukbőségű tárcsával ellátott húsdarálón megdarálunk, hozzáadunk 130 liter csapvizet, 6,5 kg konyhasót és kb. 700 ml 40%-os Na-lúgot, hogy az elegy pH-ja alapos átkeverés után is: 10 körüli értékre álljon be. Egyenletes lassú keverés közben az elegy hőmérsékletét gőzköpenyfűtéssel 65 C°-ra emeljük és ezen a hőmérsékleten elvégezzük a peroxidos kezelést. Ez úgy történik, hagy 250 mi 40%-os hidrogénpe-roxidot 4 liter térfogatira felhígítunk, ebből 1 litert hozzáadunk az elegyhez és folyamatos keverés köziben 65 C° hőmérsékletét fenntartva 30 perc alatt hoizzáf olyat juk a fennmaradó 3 liter peroxidoldatot. Ennek befejezése után a hőmérsékletet további 1 óráig 65 C-on tartjuk és a keverést folytatjuk, majd hozzáadunk 600 g ammóniumkloridot, aminek elfceveredése, ill. feloldódása után az elegy lúgossága 9,0 pH körüli 'értékre csökken. Ezután köipenyfűtássel forrásig melegítjük az elegyet, 5 perces forralás után a melegítést és keverést beszüntetjük és az edény alján elhelyezkedő sárgás, opálos levet léboosátjuk az összetapadva felül úszó tüdőimaradványokról. Nyertünk 135 liter nyers levet, visszamaradt 62 kg nagy víztartalmú koaguált tüdőmaradék, amiből enyhe .préseléssel (szőlőp résen) további 21 liter nyers lé kinyerhető. Az összes nyeredék 156 liter nyerslé, ami az U. S. P. XIV. szerinti véralvadásgátlás-test módszerével vizsgálva mil-'eniként 17,5 nemzetközi egység (N. E.) heparint tartalmaz. A nyeredék tehát 2 740 000 NE nyers heparin, ami 1 kg tüdőből 34 000 NE nyers heparin termelésnek felel meg. — Ez a nyeredék lényegesen magasabb, mint az eddig ismerétes módszerekkel elérhető nyeredékék, gyakorlatilag független a tüdő minőségétől, a gyártás igen rövid átfutási idejű, teljesen bűztelein és nem igényel költséges külső enzim hozzáadását sem. A találmány szerint előállított nyerstermékből a tiszta heparin az isimert módszerek (bármelyikével előállítható. így alkalmazható a legegyszerűbb, általánosan ismert miódszer, ami abból áll, hogy a nyers levet sósavval pH 2,0—2,5-ig savanyítjuk, a képződött heparinfehérje csapadékot üle^ pítéssel, ill. centrifugálással kinyerjük, ezt kimosva és aoetoinnal kiszárítva vízben felszuszpetndáljuk, majd tripszines emésztésnek vetjük alá, enyhén lúgos közegben. Az emésztés után nyert elegyet megsavanyítása után leszűrjük és az oldatból másfél térfogat alkohollal lecsap juk a heparint. A meggyújtott csapadékot ismét feloldjuk vízben, a fehérjenyiomoktól trikilóreoetsavas kezeléssel megszabadítjuk és alkoholos frakcionál ássál leválasztjuk a magas egységszáimú gyógyászati célra megfelelő tisztaságú heparint, anélkül, hogy az eletkrolilok eltávolítására dialízist kellene végezni, így kb. 60% kitermeléssel e találmány szerinti nyers heparinból eljutunk a végtermékhez. Nagyobb kitermelést érhetünk el, ha a találmány szerinti nyerstermékből a tiszta heparint pl. a 2,797.184. sz. amerikai szabadalom által meg-