148468. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trivalens, élő vírust tartalmazó gyermekbénulás elleni oltóanyag előállítására
2 148.468 I típus, III típus, végül pedig a II típus. A jelen találmány tökéletesen megoldja a különböző típusú vírusok interferenciájának a problémáját, a találmány értelmében olyan trivalens, élő vírust tartalmazó poliomyelitis elleni oltóanyag (vakcina) állítható el, mely egy egységes adagban kerül orális alkalmazásra és amely az alábbi törzsek keverékét tartalmazza: a) legyengített I típusú poliomyelitis-vírus, emberre nézve avirulens állapotban, b) legyengített III típusú poliomyelitis-vírus, emberre nézve avirulens állapotban, c) legyengített II típusú, csirke-embrióra adaptált poliomyelitis-vírus, emberre avirulens állapotban, amely nem gátolja az avirulens I és III típusú vírusok általi fertőzést, mimellett ez a keverék az egyes vírus-típusok mindegyikét előre meghatározott koncentrációban tartalmazza. Az ilyen legyengített II típusú poliomyelitis-vírust elsőnek az American Cyanamid Company Lederle Laboratories vállalata állított elő; a törzs legyengítése az alábbiakban leírt módon történt; az eljárás lényege az, hogy a vírust szopós rágcsáló állatok idegszövetein tenyésztik egymást követően mindaddig, míg a törzs adaptálódik a csirke-embriókon való fejlődéshez, ezután csirkeembriókon tenyésztik egymást követően a törzset mindaddig, míg az emberre nézive avirulens állapotba nem kerül. Különböző forrásokból könnyen nyerhetők olyan II típusú vírus-törzsek, amelyek alkalmasak a rágcsálók központi idegszöveteiben való szaporításra. Ezt az anyagot, rendszerint a beoltott vírust tartalmazó megőrölt idegszövet vizes szuszpenziója alakjában intracerebrálisan oltják be a szopós rágcsálóba, célszerűen kb. 1—12 napos korú hörcsögökbe. Másfajta és más korú szopós rágcsálók alkalmazása sincs kizárva, a vírus LD50 egér-titerének kialakítása és az embrionális tojásszövetben való fejlődéshez történő adaptálása során. Ezt a vírust addig hagyjuk fejlődni a szopós állatban, míg legalább néhány beoltott állaton a betegség jelei nem figyelhetők meg. Ez az időtartam a sorozatos átoltások megkezdésekor 48 óra körül van, később, amint a vírus módosulást szenved a szopós rágcsálókon történő sorozatos átoltások folyamán, kb. 18—24 órára csökken. Amint néhány beoltott szopósállaton a megbetegedés jelei mutatkoznak, az egész beoltott csoportot leöljük és a központi idegrendszeri szöveteiket kivesszük és pl. izotóniás sóoldat felhasználásával szuszpenzióvá alakítjuk; ezzel a szuszpenzióval végezzük a további átoltást nem-immúnis szopósállatokra. A megfertőzött idegszövet összegyűjtését éppen azt az időpontot megelőzően kell elvégezni, amikor a beoltott szopósállatok a bénulás fellépésének megkezdődését mutatják. Ebben az időpontban, a látható bénulás fellépése előtt az élő vírus-részecskék nagyobb koncentrációban vannak az idegszövetben. így tehát a szopós rágcsálóknak éppen a bénulási tünetek fellépését .megelőzően történő leölése útján nagyobb ikoncentrációban nyerhetjük idegszöveteikből a vírusrészecskéket. A központi idegszövet összegyűjtésének legkedvezőbb időpontját célszerűen oly módon állapíthatjuk meg, hogy egyidejűleg nagyoíbbszámú szopós rágcsálót oltunk be és akkor gyűjtjük össze a megfertőzött idegszöveteket a csoport valamennyi állatából, amikor a csoport legelső tagjainál jelentkeznek a megbetegedés klinikai tünetei. Ily módon a többi állat legnagyobbrészt abban az időpontban kerül leölésre és az idegszövet akkor kerül kitermelésre, amikor a vírus koncentrációja a maximális érték közelében van. A szopós rágcsálók beoltása, idegszöveteik szuszpenzációjának elkészítése és újabb nem-immunis szopósállatok beoltása ezután a leírt módon folytatódik sorozatosan tovább, eközben állandóan megfigyeljük a kapott szuszpenziók LD50 egér-titerét (LD50 = = átlagos halálos adag). Azt tapasztaltuk, hogy e vírustenyésztési módszer eredményeképpen a kapott vírus-készítmény LD5o-titere állandó emelkedést mutat egészen 10-5 nagyságrendű szintekig, sőt ez az emelkedés a sorozatos átoltások továbbfolytatásával 10~7 ' 5 nagyságrendű értékekig folytatódik. Ha a központi idegszövetekből készített szuszpenziók LD50 egér-titere eléri legalább a 10~5 értéket, akkor a vírust átvihetj ük inkubált tojásokra és ezután csirke-embriókon végezhetjük a sorozatos átoltásokat mindaddig, míg a vírus olymérvű módosulást nem szenved, hogy biztonságosan felhasználható élő vírust tartalmazó vakcinaként embereken vagy majmokon. Ezt az eljárást részletesen leírták az alábbi közlemények: Roca—Garcia és munkatársai: Poliomyelitis II: Propagation of MEFj Strain of Poliomyelitis Virus in Developing Chick Embryo by Yolk Sac Inoculation, Proc. Soc. Exp, Biol. & Med. 81, 519 (1952); Cabasso és mtsai: Poliomyelitis II: Propagation of MEF; Strain of Poliomyelitis Virus in Developing Chick Embryo by Allantoic Cavity, Inokulation Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 81, 525 (1952); Cabasso és mtsai: Poliomyelitis IV: Some Culture und Other Characteristics of Chick Embryo Adapted Type II Strain of Poliomyelitis Virus, Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 85, 167—171 (1954). A fentebb leírt, csirke-embrióhoz adaptált legyengített II típusú törzsből, legyengített I típusú SM vírus-törzsből és III típusú Fox vírus-törzsből készített hármas vakcinákat a Lederle Laboratories állított elő; ezeket pl. az University of Minnesota Medical Bulletin, 29, 134—136 (1957. dec.) ismerteti; e vírusok nem mutattak semmilyen nehézséget a II típusú törzsnek a Sabin-féle kísérleteket sikertelenné tevő dominálása szempontjából, fellépett azonban e vakcinák esetében egy másik nehézség. Ha e vakcinák olyan koncentrációban kerültek beadásra, hogy a vírus mindegyik típusának koncentrációja 1 millió TCD50-nél kisebb volt, akkor csalódást keltőén alacsony volt azoknak a szeronegatív felnőtt egyéneknek a százalékaránya, akiknek a szervezete a vakcina hatására antitesteket hozott létre. A vakcinák koncentrációját általában a fertőző adag közönséges logaritmusában szokták kifejezni; ezt a módszert alkalmazzuk mindvégig a jelen leírásban és az igénypontokban is. Nagyszámú felnőtt személyen végeztünk kísérletet olyan trivalens vakcinával, amely a háromféle típusú vírus mindegyikét 10 g 6,8 koncentrációban tartalmazta; a szeronegatív személyek közül az I típusú vírussal szemben 71%, a II típusú vírussal szemben 67% és a III típusú vírussal szemben 75% mutatott antitest-képződést. A fenti eredményeket felnőtt személyekkel értük el, akiknél nehezebb kiváltani
