147323. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heparin előállítására

2 147.323 2 552 507.) A 142 367 sz. magyar szabadalom a fehérjéket és a fehérje lebontási termékek egy részét a nyers heparin szerves oldószeres frakcionálással feldúsított oldatából kicsapószerrel távolítja el. Lester L. 'Coleman és L. B.; Spaiuldingl! (Upjohn) a heparint a fehérje-heparin keverékből nagy mennyiségű neutrális só jelenlétében szabadítja fel (Ú. S. P. 2 797 184). A fentiekben felsorolt eljárások kétségtelenül haladást jelentenek a tripszines tisztítással szemben, egyikük sem oldja meg azonban a heparingyártás két döntő problémáját. Kutatásaink során azt találtuk, hogy a heparinnak a heparintartalmú 'állati szervekből történő feltárása az eddig ismert utaknál egyszerűbben, könnyebben és gazdaságosabban valósítható meg, ha a megőrölt heparintartalmú szervet natív állapotában egy különleges fehérjebontó enzimmel, az elasztázzal hozzuk össze. A feltárás hatásfoka két-háromszorosára emelkedik, s ugyanakkor időtartama tetemesen megrövidül. Kutatásaink során megállapítottuk továbbá azt is, hogy az ily módon feltárt heparin-fehérje keverékből a heparin könnyen felszabadítható, ha annak gyengén savanyú, neutrális, vagy (mérsékelten alkalikus vizes oldatát, szuszpenzióját megfelelő fehérje-denaturálószerrel kezeljük, a kezelés után a denaturált fehérjét hőkoaguláljuk, vagy oldatából kicsapjuk, s eltávolítása után a iheparint az oldatból elkülönítjük. A heparintartalmú állati szövetből a heparin az elasztázzal minden korábbi eljárásnál hatásosabban és előnyösebben tárható fel, s a feltárt heparinfehérje komplexből fehérjedenaturálószer alkalmazásával egy lépésben felszabadítható. A találmány szerinti eljárás előnye minden eddigi módszerrel szemben, hogy a szövetek heparintartalmának teljes feltárását részleges fehérjeemésztéssel teszi lehetővé, s ugyanakkor idő^jgénye — a fehérjementesítési lépés1 leegyszerűsítése következtében is —• csupán fele, illetőleg egyharmada az ismert eljárásokénak. Az átfutási idő rendkívüli mértékű megrövidítése a termelési kapacitás nagymérvű növelését teszi lehetővé. Ezenkívül új eljárásunk hozama 50—100%-kal múlja felül a régieket. A találmány szerinti eljárás értelmében a heparinnak a heparintartalmú állati szövetből való feltárásakor célszerűen tigy járunk el, hogy a friss, vagy fagyasztott, megőrölt szervet 37—42 C°-ra melegítjük, a vizes szervőrlemény pH-ját mérsékelten alkalikus vegyhatásúra állítjuk be s a feltárást 7,8—9,0 pH-tartományban végezzük elasztázzal. Az irányított enzimes feltárás időtartama 1—4 óra. Különösen jó feltárást biztosíthatunk 3—5000 E. E./lkg heparintartalmú szerv enzimmennyiség alkalmazásával (E. E. = elasztáz. egység). A feltárás befejezése után a szervmaradék elkülönítését és a feltárt heparin kivonását ismert módon végezve tüdőkilogrammonként 15—40 000 NE nyers heparint nyerünk. A heparin-fehérje keverékből a heparin felszabadítását úgy végezzük, íhogy a heparin-fehérje keverékhez pH 5—10 értékek közt fehérje denaturál ószert, előnyösen karbamidot, vagy guanidinsót, vagy a kettő keverékét adjuk 0,5—2,0 mól pro liter mennyiségben, szervetlen, vagy szerves só jelenlétében. A reakcióelegybe vitt só mennyisége 1 mól pro liter koncentráció alatt van. A heparin-fehérje keveréknek fehérje denaturálószerrel való kezelését szobahőmérsékleten, vagy melegítés közben, célszerűen 20—100 C° közti hőmérsékleten végezzük. A behatás időtartama 30—120 perc, 60 C° hőmérsékleten előnyösen 30—60 perc. A denaturálószerrel való kezelést követőleg az oldatot mérsékelten savanyú közegben, pH 5,0—6,0 értékek között felfőzzük, a denaturált fehérjéket az oldatból eltávolítjuk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a. meleg, vagy szobahőmérsékletre hűtött oldathoz ásványi vagy szerves savat adunk s a fehérjéket savanyú közegben csapjuk ki az oldatból. A denaturált fehérjék elkülönítése után a heparintartalmú oldatot közönbösítjük s a heparint ismert úton, pl. szerves oldószeres frakcionálással izoláljuk. Példák: 1. 50 kg fagyasztott tüdőt finomra darálunk és 100 liter osapvizet adunk hozzá. 39 C°-ra való melegítés után a pH-t 40%-os nátronlúg hozzáadásával, keverés közben 8,7-re állítjuk be, majd a reakcióelegybe 2,5 liter 0,01 mólos nátriumhidrokarbonátban oldott 25 g elasztázt (10 E. E. pro mg hatóértékű) adunk. 3 órai emésztés után kivonatolunk, majd a hőkoagulált szervmaradékot eltávolítjuk. A savanyú kicsapással nyert heparinfehérjét 25 liter 6,5 pH-jú desztillált vízben oldjuk fel és az oldathoz 1,5 kg karbamidot, majd 1,25 kg konyhasót mérünk. Fél órai 60 C°-on való hőkezelés után az oldathoz; keverés közben cseppenként annyi 10%-os sósavat adagolunk, hogy a pH 2,5—3,0 közé essék. A kapott csapadék eltávolítása után a heparintartalmú fölöttes levet neutralizáljuk és belőle a heparint alkoholos frakcionálással nyerjük. A hozam 7,5 g 130 NE/mg hatóértékű heparin. 2. 1 kg finomra őrölt sertésmájhoz 3 liter deszt vizet adunk és a szuszpenzió pH-ját nátronlúggal 8,6-ra állítjuk be. 0,8 g elasztázt (12 E. E. pro mg hatóértékű) 100 ml 0,01 mólos dinátriumhidrofoszfát oldatban oldunk és kevertetés közben hozzáadjuk a reakcióelegyhez. 40 C°-on 4 órán át emésztünk, maid kivonás után a Iheparin-fehérjét pH 3,5-nél csapjuk le és elkülönítjük. A heparin-fehérje csapadékot ezután 500 ml deszt. vízben oldjuk, amely 15 g karbamidot és 25 g konyhasót tartalmaz. Az oldat hőmérsékletét 70 C°-ra állítjuk be és egy órai inkubálás után 40 C°-ra hűtjük vissza, kénsav hozzáadásával a pH-t 3,0-ra csökkentjük s a kicsapódó szenynyezéseket eltávolítjuk. A vizes heparin oldatból a heparint alkoholos frakcionálással különítjük el. A hozam 50 mg 102 Ne/mg hatóértékű heparin. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás heparin előállítására heparint tartalmazó állati szövetből, melyre jellemző, hogy he^parintartalmú natív szövetből a heparint 7,5—9,0 előnyösen 8,0—8,7 pH értékek közt elasztázzal tárjuk fel, a feltárt heparin-fehérje komplexet tartalmazó vizes oldathoz fehérjedenaturáló szert