146332. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a primicin fermentációs oldatokból való kinyerésére és tisztítására

146.332 3 ".mire a vízben eléggé rosszul i(20 CT-on 50 mg %-fcian) oldódó prümicin pelyhes csapadék alakjában kiválik. Szervetlen sók (pl. kloridok, szulfátok) hozzáadása jelentősen fokozza a csapadék leválásait. A levált hatóanyagot oemtrifugálással vagy vákuumszűréssel választjuk el a víziben oldható szennyeződéseket tartalmazó barna, szirupszerű anyalúgtól; a csapadékot azután vízzel mossuk és célszerűen nedves állapotban dolgozzuk fel tovább. A fehérjék eltávolítása. A tisztítandó terméket ammóniával gyengén meglúgosított (pH = 8 körül) alkoholban (pl. metanol. etanol, vízzel telített butanol) oldjuk, majd vizes vagy alkoholos ólomaoetátoldatot adunk hozzá. A fehérjék előbb, kolloidois zavarosodást képeznek, majd melegítés hatására csapadékként kiválnak. Az ólomaeetát hozzáadását célszerű kisebb adagokban mindaddig folytatná, míg a kivett és centrifugált próbák további ólomaeetát hozzáadása és melegítés Után már nem mutatnak újabb csapadékleválást. Ezután az oldatot lehűlni és ülepedni hagyjuk, majd a csapadékot (elválasztjuk és alkohollal átmossuk. A mosófolyadékat a szűredékhez adjuk; ezután széndioxid vagy kénhidrogén .bevezetése. •esetleg nátriumhidrokanbonáit vagy kénsav (hozzáadása útján eltávblitjuk az ólamacetát feleslegét az oldatból. Utána az alkoholos oldatot vákuumban besűrítjük és vizet adunk hozzá, majd ebből a vizes fázisból vízzel nem elegyedő alkohol, pl. butanol segítségével kioldjuk a primicint, A butanolos kivonatból bepárlás útján nyerhetjük ki a fehérjéktől mentesített primieiinit, Pigmens-szervnyezések eltávolítása. A primicin felületén adszorbeált pigmemisek az óidat afctív- szénnel való derítése útján csak résziben távolíthatók el. Teljes eltávolításuk céljából a fentiek szeriint tisztított primicint vízzel niem elegyedő alkohollal, pl. butanallal telített vízben oldjuk 90—95 C° hőmérsékleten, majd a forró oldatot .jelesre szűrjük. Az így kapott vizes oldatot azután forrón- extnaháljuk vízzel nem keveredő •alkohollal és észter (pl. butanol és butilaeetát) elegyének kis mennyiségével. Ez az elegy a primicint csak kevéssé oldja, a pigmenisek azonban "jól oldódnak benne, és így — esetleg a kivonási művelet többszöri megismétlésével —. eltávolíthatók a primicint tartalmazó vizes oldatból. A primicint a vizes oldatból ismét butanolos kirázás és a •butanolos oldat bepánlása útján nyerhetjük ki. A nehezen oldható szennyezések eltávolítása. A már messzemenően tisztított, legnagyobb biológiai aktivitást (0.02 meg/ml) mutató termékek még mindig tartalmaznak bizonyos mennyiségű „rosszul oldódó" frakciót. Ez szobahőmérsékleten absz. alkoholban vagy melegen vizes alkohollal vagy vizes acetoninal történő frakcionált feloldás és a nehezen oldódó frakció kiszűrése útján távolítható el. Minthogy a nehezen .oldódó szenynyezések általában primicinhez vannak kötve, a kiszűrt frakció számottevő mennyiségű primicint is tartalmaz; ennek visszanyeré,se végett ezt a frakciót visszavihetjük a feldolgozandó fehérjementes termékbe. A primicin hamutartalmát képező szervetlen vegyületek teljesebb eltávolítására beiktathatunk még egy tisztítási műveletet: a vízzel nem keveredő oldószerben oldott primiein mellől híg savas (pl. ecetsavas vagy sósavas) kirázással távolíthatjuk el a még jelenlevő víziben oldható szervetlen szennyezéseket. Kristályosítás. A primicin . végső á'tkristály.üsításia forrón telített alkoholos (metanol, etanol, butanol stb.) oldatból, esetleg jégecetes, piridines vagy dioxámos oldatból történhet. A primicin fehér mikrokristályos por alakjában válik ki az oldószerből. A közvetlenül kapott mikrokristályos termék szűrése azonban amorf, üvegszerű, gyantás anyagot eredményezihet. Ezért előnyös a 0 Cc körüli hőmérsékleten tartott kristályos tömeget centrifugálás útján elválasztani az anyalúgtól, majd aicetonnal vagy éterrel való többsziöiri átkeverés útján mosni. Az így mosott termék vákuumban való szárítása útján laza szerkezetű, hófehér színű végterméket kapunk. Az ily módon kapott tiszta primicin elemi analízise a .(C19H37-C>7N)n

tapasztalati képletnek megfelélő összetételt mutat, olvadáspontja 180 C° (Koffeirnbloklkban.). A pirlimicin terrnostaibil, alkoholokban jól oldódó anyag; más oldószerekben — a már említett vizes aceton, jégecet és dioxán kivételével — alig vagy egyáltalán nem oldódik. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjának egyes részleteit az alábbi példák 'jzemléltetik közelebbről: 1. példa: A Strsptomyoes primycini kísérleti mélyfermentációjából származó. 1 :5000 hígításban is antibiotikuis hatást mutató 70 liter ferrnentádiós levet, amelynek pH-értéke 8, híg kénsavvá! pH 3-ra savanyítunk, mire dús pelyhes csapadék válik le. amely a gomba micéliumábói és a jelenlevő fehérjékből áll, és felületileg adszorbeálva tartalmazza a fermentáció során képződött primicin csaknem, teljes 'mennyiségét. A csapadékot lazító anyagként alkalmazott kovasavval összekeverve, folyamaitos működésű centrifugáiban válaszjtjuk el a fermentációs létől, és 60 C°-os légáramban megszárítjuk. 2,5 kg száraz terméket kapunk; a centrifugából kilépő folyadék csak 1:10 hígításban mutat antibiötikus hatást. A fenti módon kapott 2,5 kg száraz terméket Soxleth-remdszerű extraiktorban 6—8 óra hosszat extraháljuk aoetonmal. Az aoetonos kivonat 510 g 'lipoid-jellegű, antibiotikus hatást nem mutató anyagot tartalmaz. A lipaidoktól mentesített száraz terméket 48 óra hosszat Soxleth-ikészülékiben^ extralhátljuk, több részletben, összesen 10 liter forró metanollal. Az egyesített metánolcs kivonatokat vákuumban 50p ml térfogatra sűrítjük be, majd 2 liter desztillált vízzel felhígítjuk. A víz hozzáadásának hatására a hatóanyag kicsapódik, ezt oentrifugálással elkülönítjük,, kevés vízzel mossuk és szívószűirőn leszűrjük. 76,5 g nedves anyagot kapunk. Az előző műveletben kapott hatóanyagot friss, nedves állapotban 3 liter 80%^os metanolban oldjuk. pH-értékét tömény ammóniumhidroxiddal 8-ra állítjuk be, majd 900 ml 1'0%-os ólom-