146263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az I-szpiramicin biokémiai átalakítására II- és III-szpiramicinné

2 146.263 kalmas szerves vegyületek és megfelelő aktivátorok — jelenlétében tartjuk. A S. ambofaciens mikroorganizmusnak az enzimrendszer kialakítása szempontjából előnyös módon való tenyésztése igen különböző tápközegekben történhet; így elsősorban a szpiramicin termeléséhez szokásosan alkalmazott komplex vagy szintetikus táptalajok alkalmazhatók erre a célra. Mindazonáltal a kialakuló acilező enzimrendszer mennyisége és minősége nagymértékben függhet az alkalmazott táptalaj összetételétől. Ezért annak érdekében, hogy az I-szpiramicinnek II- és III-szpiramicinné való átalakítására fokozott mértékben képes micéliumot kapjunk, előnyös a táptalajban alkalmazásra kerülő anyagokat igen gondosan megválogatni. Különösen előnyösnek bizonyult az olyan szintetikus táptalaj alkalmazása, amely csupán valamely energiadús szénhidrátf óriást, nitrogénforrásként valamilyen ammóniumvegyületet és valamely semlegesítő anyagot tartalmaz. Szénhidrátforrásként előnyösen glükózt vagy keményítőt alkalmazunk 1 és 100 g/liter közötti, legcélszerűbben 40 és 60 g/liter közötti mennyiségben. Az ammóniumsók közül a klorid, a szulfát vagy a nitrát alkalmazható célszerűen nitrogénforrásként, az ammónia-nitrogén mennyisége 0,1 és 10 g/liter között, legelőnyösebben 2 és 4 g/liter között lehet. A S. ambofaciens kultúra kezdeti pH-értéke kedvező átalakítási hatásfok biztosítása érdekében 5 és 9 közé, előnyösen 6,5 és 7,5 közé állítandó be. Az acilező enzimrendszer kedvező kialakítása szempontjából végzetes lehet, ha a kultúra pH-értéke a fermentáció folyamán túlságosan csökken, ennek megelőzése érdekében célszerű semlegesítő anyagokat adni a táptalajhoz; ilyén anyagok kellő időpontban és megfelelő mennyiségben való hozzáadása útján a pH-értéket a kívánt szinten tarthatjuk. Semlegesítőszerként alkalikus anyagok, mint pl. alkáli- vagy alkáliföldfémhidroxidok vagy -karbonátok alkalmazhatók vizes oldatban, vagy vizes szuszpenzióban. Eljárhatunk oly módon is, hogy már a fermentáció kezdetekor hozzáadunk a táptalajhoz tartalékkészletet képező semlegesítőszert, pl. az alkáliföldfémek vízben oldhatatlan karbonátjait. Erre a célra előnyösen kalciumkarbonátot alkalmazunk, 1 és 50 g/liter közötti, legelőnyösebben 25 g/liter körüli mennyiségben. Az acilező enzimrendszer maximális mértékű kialakítása érdekében célszerű továbbá a S. ambofaciens mikroorganizmussal történő fermentációt jól meghatározott hőmérsékleti feltételek mellett lefolytatni. A fermentáció lefolytatására pl. 20 és 35 C° közötti hőmérséklet alkalmazható, a legelőnyösebb azonban 23 és 27 C° közötti hőmérsékleten dolgozni. Egyébként a fermentáció az aerob fermentációk által kívánt szokásos feltételek mellett történhet; előnyösen bármely olyan készülékben, amely lehetővé teszi a streptomyces-gombák légzéséhez szükséges levegő alapos diszpergálását a táptalajban és egyidejűleg a kultúra kellő mértékű homogenizálását is. Azt tapasztaltuk, hogy a S. ambofaciens kultúrának az I-szpiramicin átalakítására irányuló képessége a kultúra életkorával is változik. Fiatal kultúrák esetében ez az átalakítóképesség gyakorlatilag arányos a kultúrában jelenlevő micélium mennyiségével. Bizonyos idő elteltével azonban az átalakítóképesség egy maximális értéken rögzítődik, majd csökken, még mialatt a micélium tovább folytatja fejlődését. A gyakorlatban azt tapasztaltuk, hogy a micélium átalakítóképessége a kultúra inokulálása után 30—150 órával mutatja a maximális értéket; a maximum a leggyakrabban 40 és 100 óra közötti idő elteltével áll be, ez az optimális idő lényeges mértékben függ a fermentáció általános feltételeitől is. Ha a S. ambofaciens törzsnek vagy e törzs valamely mutánsának a kultúráját az alább leírandó módon elkészítettük, akkor az I^szpiramicint lies III-szpiramicinné átalakító acilező enzimrendszer kedvező kialakítása érdekében célszerű a törzset olyan gondosan megválasztott körülmények közé helyezni, amelyek alkalmasak a mikroorganizmusok átalakítóképességének a kihasználására és a kívánt átalakítás lefolytatására. A kultúrához azután, abban az állapotban, ahogyan azt kapjuk, hozzáadhatjuk az átalakítandó I-szpiramicinnel egyidejűleg az átalakításhoz szükséges anyagokat: esetleg az acilezőszert, valamint az aktivátorokat. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a S. ambofaciens micéliumot bármilyen alkalmas módon elkülönítjük a kultúrából, és azután az elkülönített micéliumot visszük be valamely olyan tápközegbe, amely alkalmas az átalakítás lefolytatására, és amely már tartalmazza az átalakítandó I-szpiramicint, az acilálószert és az aktivátorokat. Azt tapasztaltuk, hogy az I-szpiramicinből kapott átalakítási termékek aránya jelentős mértékben függ az átalakításhoz alkalmazott közegben jelenlevő acilgyökök jellegétől. A 3 szénatomot tartalmazó acilgyökök könnyebben kapcsolódnak az I-szpiramicinre, mint a 2 szénatomos acilgyökök. Minden olyan esetben, amikor ez a kétfajta, acilgyök egyidejűleg van jelen az átalakítás lefolytatására alkalmazott közegben, elsősorban a 3 szénatomos acilgyök kerül felhasználásra, az I-szpiramicinnek III-szpiramicinné történő átalakítására. Ily módon az I-szpiramicin átalakulása specifikusan irányítható is a Ill-szpiramicin irányába, ha az adalékanyagokat céltudatosan úgy választjuk meg, hogy feleslegben legyenek jelen propionilgyököt szolgáltatni képes anyagok. Láthatjuk ebből azt is, hogy az I-szpiramicinnek specifikusan Il-szpiramicinné történő átalakítása csak oly módon hajtható végre, ha teljesen hiányzanak az átalakításra alkalmazott közegből az olyan anyagok, amelyek propionilgyököt képesek szolgáltatni az átalakulás számára. Minthogy a S. ambofaciens igen könnyen dolgozza fel a legkülönfélébb tápközegekben a propionilgyököt szolgáltató anyagokat, így az I-szpiramicinnek 'specifikusan II-szpiramicinné való átalakítása csak szigorúan specifikus körülmények között folytatható le. Azokban a fermentációkban, amelyeket az alább leírandó acilező rendszerek kialakítása céljából folytatunk le, az acetilező és propionilező anyagok bioszintézise fontos szerepet játszik. Ha ugyanezt a fermentációs rendszert átalakító közegként is hasznosítani akarjuk, akkor ebben a hozzáadott I-szpiramicin főként III-szpiramicinné vagy pedig