145681. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megnövelt III-szpiramicin tartalmú szpiramicinelegy előállítására
2 145.681 kapott kromatogramokat azután a tiszta állapotban elkülönített különböző . szpiramicinek ismert mennyiségeivel készített viszonyító kromatogramokkal hasonlíthatjuk össze. Az alábbi példák szemléltetik a találmány szerinti új eljárás gyakorlati kiviteli módját; megjegyezzük azonban, hogy a találmány köre nincsen ezekre a példákra korlátozva. 1. példa Egy 2 literes Erlenmeyer-lombikba 250 ml alábbi összetételű táptalajt töltünk: kukoricalekvár (50%-os száraz kiyonat) 40 g glükóz 20 g nátriumklorid 5 g magnéziumszulfát 1 g vízvezetéki víz 1000 ml Az elegy pH-értékét nátriumhidroxid-oldattal 6,8-ra állítjuk be, majd még az alábbi anyagokat adjuk hozzá: kalciumkarbonát szójaolaj 5 g 4 ml Ezt a táptalajt 45 percig sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten. Lehűlés után beoltjuk a Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 törzs agar-agaron nevelt kultúrájával. A beoltott táptalajt ezután 48 óra hosszat rázóasztalon keverjük. Az előbbitől függetlenül több 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50 ml-t töltünk az alábbi összetételű táptalajból: kukoricalekvár (50%-os száraz kivonat 35 g glükóz 50 g nátriumklorid 20 g monokáliumfoszfát 2 g magnéziumszulfát 1 g vízvezetéki víz 1000 ml Az elegy pH-értékét nátriumhidroxid-oldattal 6,8-ra állítjuk be. Azután hozzáadjuk még az alábbi adalékot: kalciumkarbonát 5 g Végül propionamidot adunk az egyes táptalajadagokhoz az alábbi táblázat szerinti különböző mennyiségekben. Az egyes Erlenmeyer-lombikokat 20 percig sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten, majd lehűlés után beoltjuk őket a 2 literes Erlenrneyerlombikban kitenyésztett kultúra 4 ml-jével, és 25 C° hőmérsékleten rázóasztalon rázatjuk a lombikokat. A kultúrából a 6., 7. és 8. napon mintát veszünk és a minta elemzése útján meghatároz-zuk a kultúráik maximális aktivitását és a háromféle szpiramicin egymásközötti mennyiségi arányát. Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja: < táptalaj propionamid-tartalma g/liter Maximális aktivitás mcg/ml A szpiramicinek részaránya súlyszázalékban •I. II. III. 0 285 51 26 , 23 1 205 27 18 55 2 175 24-10 66 4 150 15 7 78 2. példa Egy 170 literes f érmen torba az alábbi összetételű táptalajt töltjük: kukoricalekvár (50%-os száraz kivonat) 4,800 kg glükóz 2,400 kg nátriumklorid 0,600 kg magnéziumszulfát 0,120 kg vízvezetéki víz 100 1 Az elegy pH-értékét nátriumhidroxid-oldattal 6,8-ra állítjuk be, majd még az alábbi anyagokat adjuk hozzá: kalciumkarbonát szójaolaj 0,600 kg 0,480 1 A fenti módon elkészített táptalajt 45 percen át sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten. 25 C°-ra való lehűlés után a táptalajt beoltjuk a Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 törzs Erlenmeyer-lombikban rázott kultúrájának 250 ml-jével. A beoltott táptalajt a fermentorban 25 óra hoszszat szellőztetjük és keverjük, majd a termelő kultúrák beoltására használjuk fel. Ez utóbbi művelet a következő módon történik: 30 literes fermentorokba az alábbi összetételű táptalajt töltjük be: élesztő-autolizátum glükóz propionamid nátriumklorid magnéziumszulfát monokáliumfoszfát vízvezetéki víz Az elegy pH-értékét nátriumhidroxiddal 6,5-re , állítjuk be. Ezután még a következő anyagokat adjuk hozzá: 300 g 750 g 30 g 300 g 15 g 15 g 16,5 1 kalciumkarbonát szójaolaj 75 g 60 ml Az így elkészített táptalajt 40 percig sterilizáljuk 120 C° hőmérsékleten. Lehűlés után a táptalaj térfogata 15 liter, pH-értéke pedig 6,5. Ezután a táptalajt beoltjuk a 170 literes fermentorban elkészített inokulum-kultúra 2 liternyi mennyiségének bevitele útján, majd percenként 550 fordulattal járó lapátos keverővel keverjük és óránként 1 nv' levegővel szellőzzük, 25 C° hőmérsékleten. A művelet elején a táptalaj pH-értéke rendszerint csökken, 60 óra alatt az .5,6 értéket érve el; ez az első szakasz pontosan megfelel a glükóz mikroorganizmusok általi elfogyasztásának. A pH-érték azután 90 óra hosszat lassan emelkedik (6,2-re), majd az emelkedés meggyorsul és 100 óra alatt 7 fölé emelkedik. A fermentációs lé végső aktivitása 645 mcg/ml. A háromféle szpiramicin egymásközötti mennyiségi aránya a következő: I: 120/ 0 II: 13"/o III: 75% Az ugyanilyen táptalajjal, de propionamid hozzáadása nélkül végzett párhuzamos fermentáció során 120 óra alatt 760 mcg/ml végső aktivitást kapunk, a háromféle szpiramicin alábbi egymásközötti mennyiségi arányával:
