145314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás insulin tisztítására
2 145.314 etilalkohol tartalmú, akkor célszerűen úgy járunk el, hogy annak alkoholtartalmát az adszorbenssel való kezelés előtt 0—30 térfogat %-ra, előnyösen pl. mintegy 20 térfogat %-ra csökkentjük, pl. vákuumban alacsony hőmérsékleten történő lepárlással és e csökkentett alkoholtartalmú insulin kivonatot hozzuk össze a szilikát típusú adszorbenssel. Kiindulási oldatként használhatjuk a teljesen előkezeletlen, ún. nyers vizes insulin kivonatot is. Az insulin kivonatot 1 és 5 pH érték között, előnyösen 3,0—3,5 pH érték mellett hozzuk össze az adszorbenssel. Különösen előnyösnek bizonyult az olyan szilikát típusú adszorbensek használata, melyeket előzőleg ásványi savval kezeltünk. Igen előnyös pl. sósavval előkezelt bentonit tartalmú adszorbenst alkalmazni. Az insulin adszorpciójára megfelelőnek bizonyult a nagytétényi derítőföld, melynek montmorilloit tartalma mintegy 70%. Egyéb szilikát típusú adszorbensként megemlítjük pl. a kaolint, Decalso-t, azbesztet. Az adszorpciós technológia az alkalmazott adszorbenstől függ. Dolgozhatunk például oszloptechnikával; egy másik igen előnyös kivitelezési módnál az adszorbenst egyszerűen bele keverjük a vizes insulin oldatba. Ez utóbbi kivitelezési (módnál célszerűen 10—50 g szilikát típusú adszorbenst használunk az insulin kivonat minden egyes literére. Az adszorbensen megkötött szennyezéseket — az insulin eluálása előtt — célszerűen vízzel, vagy vízzel elegyedő szerves oldószerrel savanyú közegben, majd adott esetiben semleges közegben távolítjuk el. Az adszorbensen megkötött insulin leoldására vízzel elegyedő szerves oldószerként használhatunk pl. metanolt, etanolt, acetont vagy piridint, melyeket vízzel hígítva használunk. Az oldat lúgos kémhatásának beállítására célszemen dinatriumhidrofoiszfátot, natrium karbonátot, natrium boratot használhatunk. Különösen előnyös az aanmoniumhydroxid alkalmazása. Az eluálást 7,5— 8,5 közötti pH értéken végezzük szobahőmérsékleten, vagy annál alacsonyabb hőfokon, célszerűen 10—15 C°-cn. A szilikát típusú adszorbensről kapott lúgos kémhatású eluátumot gyengén megsavanyítjuk, célszerűen káliüomdihidrofoszfát, sósav, vagy bórsav hozzáadásával előnyösen 5,8 és 6,4 közötti pH-értékre állítjuk be, s a szerves oldószert alacsony hőmérsékleten, előnyösen 15— 20 C° között vákuumban lepároljuk. Ha az eluáló oldatot ammóniával lúgosítottuk <meg, desztillálás előtt nem szükséges semlegesítenünk, illetve gyengén savasra állítani pH-ját, mert a desztillálás folyamán az ammonia is eltávozik s így az oldat semlegessé válik. A szerves oldószer ledesztillálása után nyert kis térfogatú vizes eluátumból az insulint az ismert eljárások valamelyikével közvetlenül kristályosítjuk. 1. Példa 20 kg friss marha hasnyálmirigyből sósavas etilalkohollal nyert 100 liter insulin kivonatból az alkoholt vákuumban 25 C°-on lepároljuk. A kb. 11 liter térfogatra besűrített vizes oldatot 50 C°ra melegítjük, majd redős szűrőn szűrjük. A víztiszta, sárgaszínű szűrlethez, melynek pH-ja 1,0, térfogata 10 liter, szobahőmérsékleten 200 g nagytétényi derítőföldet adunk és 3 órán át kevertetjüik az oldattal. Az adszorpció befejezése után az adszorbenst nutseholjuik, ezután előbb 1 liter 0,01 N sósavval, majd annyi deszt. vízzel mossuk, hogy a mosóié neutrális kémhatású legyen. A mosás végén az adszorbenst nutseholjuk, vagy centrifugáljuk. A hormon leoldását ammóniával pH 8,5-re beállított 80 térfogat %-os etilalkohollal végezzük. 2 liter oldószert használunk két egymást követő részletben, az eluálások időtartama 1—1 óra. Az egyesített eluátumból az alkonolt és az ammóniát 15 C° hőmérsékleten 15—25 Hg mm-es vákuumban távolítjuk el. A bepárlás végén a vizes eluátum össztérfogata 250 crn3 . Az adszorpcióval tisztított insulint az 'oldatból közvetlenül kristályosítjuk. A kristályos formában nyert insulin hozama a kivonatban mért hatóérték 80—90 %-a. 2. Példa 20 kg marha pankreászból foszforsavas etilalkoholos kivonással nyert 70 térfogat %-os alkoholtartalmú insulin kivonatban az etilalkohol koncentrációját vákuumban történő lepárlással 20 térfogat %-ra csökkentjük. A csökkentett alkoholtartalmú kivonatot 50 C°-ra melegítjük, majd szobahőmérsékleten tisztára szűrjük. A víztiszta oldathoz, melynek térfogata 30 liter, pH-ja 3,0— 3,5 között van, 900 g nagytétényi derítőföldet adunk. Az adszorpciót 10 C°^on 3 órai mechanikus kevertetéssel végezzük. Befejezése után az adszorbenst ülepítjük és az oldattól elkülönítjük: A szennyező anyagokat előbb 3 liter 20 térfogat %-os savanyú etilalkohollal, majd 3 liter 70 térfogat %-os vizes etilalkohollal távolítjuk el. A mosás befejeztével a tisztított insulint 6 liter 70 térfogat %-os ammonias etilalkohollal oldjuk le két lépésiben. Az eluáló oldat pH-ja 8,0. Az egyesített eluátumból az alkoholt és az ammóniát vákuumban desztilláljuk le, 'majd az insulint vizes oldatából közvetlenül kristályosítjuk. A kristályos formában nyert insulin hozama a kivonatban mért hatóértékhez viszonyítva 60—80 %. 3. Példa 20 kg vegyes (sertés, marha, birka, ló) eredetű, fagyasztott hasnyálmirigyből foszforsavas etilalkoholos kivonással nyert 100 liter nyers insulin kivonatból a vércukorszintet csökkentő hormon adszorpcióját és leoldását a 2. példában leírtak szerint végezzük. Az eluátum két részletének egyesítése után az alkoholos oldathoz, amelynek pH-ja 6,8—7,2, annyi koncentrált ecetsavat adunk cseppenként, állandó keverés közben, hogy az oldat pH-ja 5,7—6,1 határértékek közé álljon be. Ezrután az etilalkoholt ledesztilláljuk, végül a tisztított insulint vizes oldatából az ismert kristályosítási módszerek valamelyikével közvetlenül kristályosítjuk. A kristályos formában kinyerhető insulin hozama a kivonatban mért hatóérték 50— 70 %na. 4. Példa 2 kg fagyasztott sertés hasnyálmirigyből oxálsavas etilalkoholos kivonással nyert extraktuniból
