136148. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermensek kristályosítására és tisztítására
Megjelent 1953. évi december hó 15-én. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 336.148. SZÁM. 12 P . 11-17. OSZTÁLY. - Sch-6224. ALAPSZÁM Eljárási fermensek kristályosítására és tisztítására Schering A. G. cég Berlin A bejelentés napja: 1942. augusztus 22, Németországi elsőbbsége: 1941. augusztus 23. mely literenként 1/100 ekvivalens = 0,6511 g KCN-t tartalmaz. A dialízis tartama- 48 óra. A be^ső folyadékot, amint a higanytól megszabadítottuk, a fermens kitermelésére száraz por alakjában tovább dializáljuk, amikor is külső folyadékként 1/1000 n ammóniát és azután, az ammóniumszulfát eltávolítására vizet használunk. Végül a terméket vákuumexszíkkátorban 0°-on megszárítjuk. Kb. 0,7 g tiszta fermenst kapunk. A fenti példában kiindulási anyagul használt enoláz-készítményt következőképen állíthatjuk elő: Levegőn szárított sörélesztőből kapott Lebedewléből acetonnal való frakcionált kicsapással enoláz, tartalmú csapadék nyerhető. E csapadék vizes oldatát alkohollal kétszer frakcionáltan kicsapva pH= 4,76-nál tisztítjuk, azután /pH=4,65-nél acetát-puffer jelenlétében élesztőnukleinsav oldatával kicsapjuk. A kapott nukleoproteidcsapadékot éppen elégséges mennyiségű n/10 nátronlúg jelenlétében vízben feloldjuk, pH=4,6-nál szturinszulfát hozzáadásával a nukleinsavat kiesapjuk, a tiszta oldat pH-ját 6,2-re állítjuk be, az oldathoz magnéziumszulfátot adunk és 15 percig 53 C°-ra melegítjük. A képződő csapadékot félretesszük. Az oldatot n/1000 ammóniába dializáljuk és alacsony hőmérsékleten megszárítjuk. A száraz készítmény 50%-ia tiszta fermentum. ' 2. Példa: 1 rész finoman elosztott izmot 8 rész vízzel egy ideig 0°-on kavarunk, azután centrifugálunk. A felszínen levő folyadékot ecetsavval pH=5,l'0-re megsavanyítjuk és centrifugáljuk. A tiszta oldathoz térfogatának kb. 1/100-át kitevő mennyiségű nukleinsavoldatot adunk, mely köbcentiméterenként, kb. 50 mg savat tartalmaz. Ezután a pH-értéket újra, 5,10-re állítjuk be, a -csapadékot centrifugáljuk, majd 7,4 pH-s foszfátpufferoldat kivonattérfogatának kb. 1/30-ában oldjuk, 5 percig 60°-ra hevítjük, gyorsan lehűtjük és centrifugáljuk. A folyadékhoz ugyanolyan térfogatú, dm3 -ként 20 mg szalmiredinoldatot tartalmazó oldatot adunk és a csapadékot centrifugáljuk. Á felszínen levő részt acetátpuff er hozzáadásával pH==6,60-ra állítjuk be és 31,5 tér-Fermensek tiszta állapotban való előállítása, főleg annak következtében, hogy igen nehéz őket kikristályosítani, eddig igen ritkán sikerült. Azt találtuk már most, hogy fermensekhez tiszta állapotban úgy juthatunk, hogy a fermenseket előzetesen tisztított oldataikból könnyen és jól kristályosodó higanysóikká alakítjuk át, ezekből a higanyt átkristagosítással, mely szükség esetében megismételhető, lehasítjuk és az oldatból a fermenst elválasztjuk. Ily módon például élesztőből az enoláz erjedési fermenst, izmokból glikolos fermenst, a patkány Jensen szarkomájából erjedési fermenst és másefféléket legtisztább állapotban állíthatunk e'ő. A higanyt a fermensek higanysóiból magában véve ismert módon, pl. káüumeianidoldatba dializálva lehet eltávolítani. 1 .Példa: 2 g élesztőből készült, előzetesen tisztított enoláz-készítményt 1/10 normális vizes ammóniaoldatban, melyet amrnóniumszulfát hozzáadásával félig telítettünk. 40 cm3 -re oldunk. Ezután higanyszulfátnak félig telített vizes ammonszulfátoldatban való oldatából 4 cm3 -t adunk hozzá. A higanyszulfátoldát cm3 ként 10 mg higanyt tartalmaz és, mielőtt a f érmen soldathoz adnók, erős ammóniával lakmuszra közömbösítjük. Miután a higanyszulfátot a fermensoldathoz hozzáadtuk, az oldat cm3 -ként kb 1 mg higanyt tartalmaz. Az oldatot lapos csészében szárítószerként kovagélt tartalmazó, nem evakuált exszikkátorba állítjuk. Kb. 3 óra után a fermens higanysója kristályosodni kezd; a kristályosodás 12 óra multán ér véget, y A kristályokat lecentrifugáljuk és ammonias vizes ammonszulfátoldatban, mely 65%-os telítésű, centrifugán mossuk. A higanysó megbontására a kristályokat kb. félig telített ammóniás ammonszulfátoldatban oldjuk. Dializáló készülékként celloféntömlőt használunk, melybe a fent leírt módon készült higanysótartalmú oldatot betöltjük. Külső (dializáló) folyadékként félig telített ammóniumszulfátoldatot használunk,
