Varga Máté - Szentpéteri József (szerk.): Két világ határán. Természet- és társadalomtudományi tanulmányok a 70 éves Költő László tiszteletére - A kaposvári Rippl-Rónai Múzeum közleményei 6. (Kaposvár, 2018)
Csapó János: Új módszer a fosszilis csontok korának meghatározására az aminosavak racemiációja alapján
38 CSAPÓ JÁNOS rolt fehérje hidrolizátum) keverjen össze 15 pl reagenssel (8 mg OPA és 44 mg TATG feloldva 1 ml metanolban). Ezt követően az oldatot 100 pl nitrogén átbuborékoltatásával jól összekevertük, majd 6 percig állni hagytuk. E reakcióelegyből - az injektáló apparátus előzetes átöblítése után - 25 pl-t injektáltunk az analitikai oszlopra. Az injektálást befejezve a rendszert 100 pl aceton:víz 70:30 arányú elegyével háromszor átöblítettük. Azenantiomerekszétválasztása és meghatározása. Az enantiomerek szétválasztását fordított fázisú (250x4.6 mm belső átmérő, 5 pm részecskeméret, Kromasil oktil (C8) töltet) kromatográfiával végeztük. Az oszlop élettartamának megnövelésére a mintaadagoló és az analitikai oszlop közé egy biztonsági oszlopot (RP8, Newguard, 25x3.2 mm belső átmérő, 7 pm részecskeméret, Brownlee), a pumpa és a mintaadagoló közé pedig egy tisztítóoszlopot (C18, 36x4.5 mm belső átmérő, 20 pm részecskeméretű Rsil) csatlakoztattunk. Az enantiomerek szétválasztására egy két komponensből álló gradiens rendszert alkalmaztunk, melynek összetétele az alábbi volt: A=40% metanol foszfát pufferben (9.5mM, pH=7.05); B=acetonitril. Az áramlás sebessége 1 ml/perc volt; a gradiens pedig az alábbiak szerint változott az idő függvényében: Idő (perc)A(%) B(%) 0 95 5 10 95 5 35 83 17 55 72 28 56 67 33 74 67 33 75 62 38 A FLEC és az OPA/TATG módszer összehasonlítása Összehasonlítva az 1 -(9-fluorenil)etil kloroformátos (FLEC) és az o-ftálaldehid/2,3,4,6-tetra-0-acetil-1 -tio-ßglükopiranozidos (ОРАЯАТф módszert aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására - anélkül hogy a két módszer között rangsorolni akarnánk - az alábbiakat lehet elmondani:- Mindkét módszer kiválóan alkalmas az aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására, mert a származékképzés során egyiknél sem tapasztalható számottevő racemizáció.- A FLEC módszer talán előnyösebb akkor, ha megfelelően nagy mintamennyiség áll rendelkezésünkre, és nem különösebben érdekelnek bennünket az aszparaginsav enantiomerjei. Az OPA/TATG módszerrel az aszparaginsav enantiomerjei tökéletesen szétválaszthatok.- Az OPA/TATG módszer előnyösebb akkor, ha igen kis anyagmennyiségek állnak rendelkezésünkre (pl. kevesebb, mint 1 mg kis fehérjetartalmú mikrofosszília), vagy a minta sok ásványi anyagot tartalmaz.- A FLEC módszer igen nagy előnye, hogy alkalmas az iminosavak szelektív származékképzésére, a (+)FLEC és (-)FLEC alkalmazásával pedig - a megváltozott elúciós sorrendet kihasználva - a csúcsok azonosításának biztonsága megnő, illetve a mintában elő sem forduló enantiomer retenciós idejét is meg lehet határozni.-Végső összegzésként tehát elmondható, hogy mindig az analizálni kívánt anyaghoz kell a módszert igazítani, és az analizálandó mintáról kapott információk alapján kell a módszer felől dönteni. A hagyományos és a magas hőmérsékleten végzett fehérje hidrolízis hatása az aminosavak racemizációjára Tanulmányozva az aminosavak racemizációját tiszta fehérjék, a tejpor és a szabad aminosavak hagyományos módon végzett hidrolízis körülményei között (6M HCl, 110 °C, 24 h) és magas hőmérsékleten rövid ideig tartó hidrolízis időt alkalmazva a következőket lehet megállapítani:- A szabad aminosavak racemizációja lényegesen lassúbb a peptidláncban kötött aminosavakhoz viszonyítva. Ugyanolyan körülmények között a szabad aminosavaknál előforduló racemizáció csak mintegy 20-40%-a a peptidkötésben lévőkhöz képest.- Hagyományos módszerrel végezve a fehérje hidrolízisét másfél, két és félszer nagyobb a racemizáció, mint magas hőmérsékleten (160-180 °C) a fehérje tökéletes hidrolízisét eredményező körülmények után. Ez a lényegesen alacsonyabb racemizáció magyarázható azzal, hogy magas hőmérsékleten a fehérje gyorsabban hidrolizál szabad aminosavakra, és a szabad aminosavak racemizációja lényegesen lassúbb, mint a fehérjeláncban kötötteké. Alacsony hőmérsékleten hosszabb ideig végzett hidrolízisnél a peptidláncban kötött aminosavakat hosszabb ideig érik a racemizációt kiváltó hatások, tehát minden olyan hatás, amely meggyorsítja a hidrolízist, csökkenti a racemizációt.
