Hidrológiai Közlöny, 2016 (96. évfolyam)
2016 / Különszám - Riba Milán, Kériné Borsodi Andrea, Újvárosi Andrea Zsuzsanna, Vasas Gábor: Microcystis izolátumok peptid-variabilitás vizsgálata
80 Hidrológiai Közlöny 2016. 96. évf. különszám izolátumokat fénymikroszkóp segítségével azonosítottuk. A vizsgálatokhoz szükséges sejttömeg eléréséhez izolátumainkat nagyobb mennyiségben Allen tápoldatban axenikus körülmények között 28°C-on, 5% C02 buboré- koltatás, 35-100 lu m'V mellett neveltük. A sejteket 7 nap után centrifugáltuk (Beckman Avanti J-25, 5000 rpm, 5 perc), és liofilizáltuk (Christ Alpha 1-2 LD Plus lyophilizer). A filogenetikai analízis a liotílizált mintákból DNS izolálásával (fenolos-kloroformos módszer) és specifikus primerekkel történt (27F-Lane, 1991; CYA781R-Nübel és társai 1997). Az oligopeptid mintázat meghatározásához a liotílizált mintákból (25 mg) meta- nolos extraktumot készítettünk: a sejtekhez bidesztillált vízben háromszori fagyasztás-olvasztás után 1:1 arányban metanolt adtunk, a kivonatokat kevertetés után centrifugáltuk (Beckman Avanti J-25, 13000 rpm, 5 perc), a felülúszókat a méréshez optimális arányban hígítottuk. A métából it vizsgálatok LC/MS módszerrel történtek (Positive ion mode, MS3 (CID); C18 Kinetex XB-C18, 100 mm x 2.1 mm x 2.6 pm; víz + 0.1 % HCOOH, MeCN + 0.1% HCOOH gradiens), az oligopeptideket MS/MS fragmentációs mintázat alapján azonosítottuk (Welker és társai 2006, Mayumi és társai 2007). EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK A Balatonból származó vízminták közül 29-ben találtunk Microcystis fajokat. Az izolátumok faji szintű meghatározása 16S rRNS gén szekvenciája alapján történt. Az izolátumaink M. flos-aquae, M. aeruginosa, M. ichthyoblabe és M. novacekii fajokoz állnak a legközelebb. A filogenetikai vizsgálat során a M. aeruginosa törzsek külön csoportokat alkottak, míg a többi fajhoz tartozó sejtvonalak egyetlen heterogén klaszterbe kerültek be (1. ábra). A vizsgált sejtvonalaink több mint felében teljesen vagy részlegesen azonosítottunk különböző oligopeptideket. Mennyiségi megoszlást tekintve az azonosított oligopeptidek 71%-a mikrogininek közé sorolható, a többit mikrocisztinek és anabaenopeptinek adták közel azonos arányban. A mikrogininek (1. táblázat) közül a már ismert mikroginin FR3 (m/z 728,3 [M+H]+) variáns volt jelen a legnagyobb mennyiségben. Ezen variáns metilált változata, a mikroginin FR4 csak kis mennyiségben volt megfigyelhető (Welker és társai 2006). Mintáinkból több eddig ismeretlen mikroginin változat is előkerült: a nagy mennyiségben jelenlévő mikroginin 564 MS/MS fragmentációs mintázata nagyfokú hasonlóságot mutatott az FR3-mal, melyből arra következtettünk, hogy a mikroginin 564 az FR3 variáns egy Tyr egységgel kisebb változata. Kis mennyiségben volt jelen a mintákban a mikroginin 578, amely MS/MS fragmentációs mintázata alapján a mikroginin 564 variáns metilált változata. További változatok a mikroginin 620 és mikorginin 783, melyeknél az első pozícióban egy metilált Ahda található, amelyet Val-MeLeu-HTyr aminosavak követnek, a mikroginin 783 egy további Tyr aminosavat is tartalmaz az ötödik pozícióban. Carneiro és munkatársai (2012) egy brazíliai Microcystis sejtvonalból azonosítottak hasonló új variánsokat, de esetünkben az első és harmadik pozícióban lévő aminosavak egyaránt metiláltak. Mintáinkban még mikroginin-jellegű metabolitok is voltak (m/z 416,3 [M+H]' és m/z 402,2 [M+H]"), melyek egy Tyr elvonásával vezethetők le az 564 és 578 variánsokból. Ezek azonban már nem sorolhatók a mikrogininek közé. CYA 35 2 CYA 39 CYA 35 1 CYA 31 CYA 29 CYA 25 CYA 24 CYA 23 CYA 10 CYA 1409 1 CYAV4 • CYA IV 5 CYA IV 4 CYA IV 3 CYA II 9 CYA II 8 CYA I 4 Í rYA 20 CYA II 1 CYA V 1 CYA 243 CYA V 7 CYA 17 ' CYA 27 CYA 30- M wesenbergii NIES 107 M ichthyoblabe TC24 M flos aquae strain UWOCC N CYA 16 M viridis NIES 102 ■ M aeruginosa NIES 843(T) 78"! M novacekii BC18 - CYA 34 4Ü‘- Synechococcus elongatus PCC 7942- Anabaena variábilis ATCC 29413 0.05 1. ábra. A balatoni Microcystis fajok filogenetikai fája Figure 1 . The phylogenetic tree of the Lake Balaton Microcystis species (Magyarázat: Készült 16S rRNS szekvenciák alapján Maximum- likelihood módszerrel Kimura 2-paraméter modellt alkalmazva MEGA6 programcsomaggal (Kimura 1980; Tamura és társai 2013). A méretvonal bázispáronként 0,05 nukleotid-szubsztitúciónak felel meg. Külcsoport Synechococcus elongatus PCC 7942 és Anabaena variábilis ATCC 29413.) A második leggyakoribb metabolit csoport az anabaenopeptineké volt, izolátumainkból három ismert és kettő nagyon hasonló metabolitot detektáltunk (/. táblázat). Az ismert anabaenopeptinek közül a B, az F/E és a G változatok (Welker és társai 2006) kerültek elő, mindegyikük igen alacsony intenzitással. Az izolátumokban nagyobb mennyiségben voltak jelen az eddig részlegesen azonosított molekulák: az anabaenopeptin 871 és az anabaenopeptin 885. MS3 fragmentáció alapján a molekulák alapját képező 5 aminosavból álló gyűrű ismert, előző esetében megegyezik a B, utóbbinál pedig az F/E variánséval, de a karboxil csoporthoz kapcsolódó rész eddig ismeretlen (Mayumi és társai 2007). Mikrocisztineket mindössze két izolátum esetében detektáltunk. Ezekben a mintákban igen magas volt a mikrocisztin-RR variánshoz tartozó csúcsok intenzitása. Ezen kívül közel azonos intenzitásban voltak jelen
