Hidrológiai Közlöny, 2016 (96. évfolyam)
2016 / Különszám - Nagymáté Zsuzsanna, Jurecska Laura, Romsics Csaba, Mészáros Éva, Tóth Fanni, Pohner Zsuzsanna, Márialigeti Károly: Deklorináló mikroba közösségek molekuláris biológiai módszerekkel történő jellemzése
Nagymáté Zs. és társai: Deklorináló mikroba közösségek molekuláris biológiai módszerekkel történő jellemzése 71 jelenlétének és sejtszám értékeinek meghatározásával, valamint a folyamatban szerepet játszó katabolikus gének kimutatásával követtük nyomon. Floureszcens In Situ Hibridizációs technika alkalmazásával meghatároztuk a Dehalococcoides nemzetségen kívül az tenyészetekben jelenlevő Bacteria és Archaea dómén sejtszám értékeit is. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Triklór-eténel szennyezett területekről származó talajvizekből, anaerob körülmények között, dehalogenációra képes mikroba közösségek izolálását végeztük. Az izolált mikroba közösségek inokulumként való felhasználásával, 0,5L térfogatban háromfázisú - gáz, folyadék és szilárd fázis - dúsító tenyészeteket (mikrokozmoszokat) hoztunk létre ( Mészáros és társai 2012). A hatékonyabb TCE bontás elérése érdekében a különböző területekről származó mikroba közösségekkel továbbá kompozit inokulumokat hoztunk létre. A TCE hatékony bontására képes 0,5L kiindulási térfogatban létrehozott mikrokozmoszok inokulumként való felhasználásával 2L, illetve 5L térfogatú mezokozmoszokat hoztunk létre. A mikro- és mezokozmoszokhoz szennyezőanyagként/elektron akceptorként TCE-t adagoltunk, amelynek biodegra- dációját 2-3 hetes időközönként gázkromatográfiás mérési módszerrel követtük nyomon, HP 5890 típusú, lángionizációs detektorral és HP-PLOT Q típusú kolonnával (15 m x 0,530 mm) felszerelt gázkromatográf alkalmazásával. A molekuláris mikrobiológiai vizsgálatokhoz 2,3 liter talajvízmintákat 0,2 pm-es Millipore memb- ránszürőn, vákuumszűrő berendezés alkalmazásával szűrtük le. A mikrokozmoszokból anaerob módon 2 mL mennyiségű mintát vettünk, melyek lebegőanyag tartalmát 12000 g-n, 5 percig szobahőmérsékleten centrifugálva ülepítettük. A talajvíz, illetve a mikrokozmoszokból származó mintákból a genomiális DNS kivonást UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO-BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, USA) alkalmazásával végeztük a gyártó utasítása szerint. A Bacteria dómén és a Dehalococcoides nemzetség ki mutatása 16S rDNS alapon történ polimeráz láncreakció (PCR) módszerével (Mészáros és társai 2012). A TCE eténig történő redukciójában résztvevő reduktív dehalo- genáz gének, úgymint a triklóretén-reduktáz, a két vinil- klorid reduktáz (vcrA és bvcA) gének kimutatására polimeráz láncreakció (PCR) módszerét optimáltuk Mészáros és társai (2012) által közöltek alapján. A teljes bakteriális közösség szerkezetét Terminális Restrikciós Fragment Hossz Polimorfizmus (T-RFLP) módszerével tártuk fel (Mészáros és társai 2012). A mikrokozmoszokban jelen levő teljes sejtszám értékek meghatározása a DNS molekulák adenin-timin gazdag régiójához erősen kötődő fluoreszcens festék, a DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindol) alkalmazásával történt. Dehalococcoides nemzetség, illetve a Bacteria és az Archaea dómén mennyiségbeli arányait 16S rRNS alapon Floureszcens In Situ Hibridizációs (FISH) technika alkalmazásával végeztük. A sejtek, illetve a 16S rRNS molekulák fixálása a DAPI és a FISH módszer során egyaránt 4%-os paraformaldehid (PFA) oldattal történt, 4°C-on egy éjszakán keresztül. A fixált mintá- kat/sejteket 0,2 pm-es Millipore membránszűrőn, vákuumszűrő berendezés alkalmazásával szűrtük le. A teljes sejtszám értékek meghatározására a fixált min- ták/sejtek szűrését követően lpg mL'1 koncentrációjú, 30 pL DAPI festékkel festettük, szobahőmérsékleten 2- 3 perces inkubációval. A fixált sejtek sejtfalának átjárhatóságát a flouressz-censen jelölt próbák bejutásának céljából, 2 illetve 4 mg mL"1 koncentrációjú proteináz- K, illetve lizozim enzimekkel biztosítottuk. A Bacteria, illetve Archaea dómén tagjainak kimutatására az Eub338-Cy3 (Amann és társai 1996), valamint az ARC915-Alexa Fluor 546 (Amann és társai 1995) próbákat, míg a Dehalococcoiedes nemzetség kimutatására Dhel259-Alexa Fluor 546 próbát alkalmaztuk (Yang és Zeyer 2003). A specifikus, fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próbák és a cél rRNS szekvenciák hibridizációját Amann és társai (1996) által közöltek alapján optimáltuk. 1. ábra. A TCE bomlás termékeinek, illetve a metán koncentrációjának alakulása az M-jelzésű mikrokozmoszban a lépték növelést, átoltást megelőzően [M0(2L)] valamint a létrehozott 5L térfogatú mezokozmosz [M4(5L)] négy hónapos időtartam alatt Figure 1. Concentration of methane and daughter elements released by TCE biodegradation in the microcosms signed M before and after scaling up to 2L [M0(2L)j and 5L volume EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK izolált közösségekkel létrehozott mikrokozmoszok eltérő A szennyezett területekről származó, inokulumként al- teljes bakteriális közösségszerkezettel voltak jellemezhekalmazott deklorináló mikroba közösségek, illetve az tőek, melyek összetétele időbeli változást mutatott. To-
