Hidrológiai Közlöny, 2014 (94. évfolyam)

2014 / 1. szám - Petruska Fanni - Geda Orsolya - Resetár Anna - Ajtay Kitti: A lemna-minor, a Lemna trisulca és a Wolffia arrhiza tenyészetek cilindrospermopszinnal szembeni érzékenységének összehasonlító vizsgálata

PETRUSKA F. - GEDA O - RESETAR A. - AJTAY K.: A Lenma minor ... tenyészetek ..

77

kedett glutation-S-transzferáz és glutation-peroxidáz aktivitást mért.

Vizsgálatunk célja az volt, hogy megismerjük a CYN hatására bekövetkező pigment-, fehérjetartalom, valamint peroxidáz enzim aktivitás változásokat. Eredményeink, különös tekintettel az oxidativ stresszenzimek közé tartozó pe- roxidázokra, a szakirodalomra nézve új adatokkal szolgálhatnak.

Anyag és módszer

A vizsgálataink során használt Aphanizomenon ovalis- porum (Forti, ILC-164, a DE TTK. Növénytani Tanszék gyűjteményében BGSD-423) törzs az 1994. évi izraeli kin- neret-tavi toxikus vízvirágzásból származó CYN termelő i- zolátum (Banker et al. 1997, Vasas et al. 2002). Tenyésztése kontrollált körülmények között Allen tápoldatban történt (Allen 1968, Vasas et al. 2004). A stacioner fázisban lévő tenyészet összegyűjtött és liofilizált sejttömegét Allen tápoldatban (Allen 1968) felszuszpendáltuk. A cianotoxin minél hatékonyabb feltárása érdekében a sejteket többszöri ismétlésben lefagyasztottuk és 15-20 percig rázatva hagytuk felengedni, majd centrifugáltuk (13000xg, 10 perc) és az így kapott sejt- és törmelékmentes felülúszót használtuk a nyers kivonattal (megnevezése: „CYN tartalmú nyers kivonat”) történő kezelésekhez (Jámbrik 2009, 2010). A felülúszó C- YN tartalmát kapilláris elektroforézis módszerével határoztuk meg (Vasas et al. 2002, 2004). A kísérletekhez Lemna minor, Lemna trisulca és Wolffia arrhiza vízinövények tenyészeteit használtuk. A növényanyagaink származási helyeit tekintve a Lemna minor tenyészetek a Kis-Balatonból, Csarodáról és Monostorpályiról származnak. A Wolffia arrhiza törzstenyészetekhez a növényegyedek a Kis-Balaton- ból, a Lemna trisulca növények Csarodáról származnak.

Az axenikus tenyészetek előállításához a begyűjtött növényeket hígitatlan háztartási hypo oldattal mostuk, majd steril desztillált vízzel kétszer leöblítettük, és MS (Murashige és Skoog 1962) tápoldatba tettük. Szükség esetén ezt a műveletet többször is elvégeztük, amíg az MS tápoldat már víztiszta maradt, baktériumok, gombák nem voltak kite- nyészthetők. Ezt követően a tenyészeteket fokozatosan Allen tápoldatra (Allen 1968) szoktattuk.

A növénytesztekhez 3ml-es steril Microtiter® lemezeket használtunk. A növények kiindulási száma: a Lemna minor esetében 6 levélszerü hajtás (2x3), a Lemna trisulca esetében 3 hajtás (1x3) és a Wolffia arrhiza esetében 10 egyed volt. A kezelésekhez az Allen tápoldatokat a végtérfogat megtartásával CYN-t tartalmazó, nyers cianobaktérium kivonatokkal dúsítottuk (0, 0,1, 1, 10 pg CYN ml '' tápoldatok). Az 5 napos kezelési idő optimálisnak bizonyult, mivel a kísérletekhez alkalmazott 3 ml-es tesztrendszerekben a 6- 8. napon nőtték be a növények a tápoldat felszínét, így a kolóniák nem gátolták egymás növekedését.

A növények klorofill tartalmának meghatározását 80%- os acetonos kivonatban, Shimadzu UV/VIS 1601 típusú spektrofotométerrel végeztük (Szöllősi et al. 2010). A klo- rofill-a és -b koncentrációkat a Wellburn (1994) által ajánlott képletek szerint számoltuk.

A növényekből fehérjekivonatokat készítettünk (Jámbrik et al. 2010), melyek fehérjetartalmát Bradford (1976) módszerével határoztuk meg.

A pirogallol peroxidáz aktivitások kimutatása natív poli- akrilamid géleken történt Harris és Hopkinson (1976) módszere szerint. A mintatartó helyekre egységnyi nedves tö- megnyi fehérje-kivonatokat vittünk fel. A gélek értékelése ImageJ® szoftver segítségével történt.

Eredmények és megbeszélésük

A kontroll Lemna minor növények nedves tömegre vonatkozott klorofill-a tartalma 8,3-11,5 pg mg’1, míg klorofill -b tartalmuk 3,1-4,4 pg mg'1 értékek között változott. A C- YN tartalmú nyers kivonatok hatására a növényekben a pigment tartalom csökkenése jellemző, de a csökkenés nem lineáris, és az izolátumok érzékenysége között is különbségek mérhetők (l.A és B ábrák). 0,1 pg ml’1 CYN koncentrációnál csökkent a klorofill-a és klorofill-b tartalom a Lemna minor izolátumokban. 1 pg ml’1 CYN tartalmú nyers kivonat hatására a monostorpályi Lemna-k kivételével a növények pigmenttartalma nem csökkent tovább, sőt megközelítette és a csarodai izolátumoknál kismértékben meg is haladta a kontrollok értékeit. A növények klorofill tartalmának szignifikáns csökkenése csak 10 pg ml'1 CYN kezelésnél következett be (1.A és B ábrák). A Wolffia arrhiza és Lemna trisulca esetében az egységnyi nedves tömegre vonatkoztatott klorofill tartalmak nagyon alacsonyak (Kl-a: 0,8± 0,075, ill. 1±0,08, a Kl-b: 0,27±0,024 és 0,5±0,03 pg mg’1). A pigment adatok alapján a L. trisulca növekedését 0,1-1 pg ml"1 CYN tartományban a nyers kivonat serkentette, gátlást csak 10 pg ml'1 CYN tartalmú kivonat okozott (l.A-B ábrák). A W. arrhiza a pigment adatok alapján érzékenyebbnek mutatkozott, bár 0,1 pg ml'1 toxin koncentrációnál a nyers kivonat még serkentő hatású volt, de >1 pg ml'1 CYN már a növények pigment tartalmának csökkenését o- kozta (l.A-B ábrák). Az általunk vizsgált CYN kezelt vízinövények közül a klorofillok tartalmában a legnagyobb mértékű, 80±3%-os csökkenést a monostorpályi, míg a legkisebbet, 55±2%-ost, a kis-balatoni L. minor mutatta 10 pg ml'1 CYN koncentrációnál (1. ábra). A CYN kezelések klorofill tartalom csökkenést idézték elő Hydrilla verticillata növényekben, ami a fotoszintézis folyamatának zavarára u- talt (Kinnear et al. 2008).

A CYN kezelt Lemna növények fehérjetartalma a klorofill tartalommal ellentétes változást mutatott (1. és 2. ábrák). 0,1 és 10 pg ml'1 CYN tartalmú kivonatok a növények fehérjetartalmának emelkedését okozták, míg az 1 pg ml'1 C- YN tartalmú kivonatokat tartalmazó tápoldatokban nevelt növények fehérjetartalma a kontroll növényekéhez hasonló értéket mutatott (2. ábra). Fehérjetartalmukat tekintve, közel azonos érzékenységet mutattak a különböző helyről gyűjtött Lemna minor növények. A Lemna trisulca esetében 0,1-1 pg ml'1 CYN tartalomnál a kontroliokénál kevesebb volt a kezelt növények fehérje tartalma, de 10 pg ml'1 CYN koncentrációjú kivonatokban már a kontrollokhoz viszonyítva kétszeres fehérjetartalom mérhető. Ezzel ellentétes volt a Wolffia arrhiza fehérjetartalmának változása, amely 0,1-1 pg ml"1 CYN tartalomnál kis mértékben megnőtt, majd 10 pg ml'1 CYN hatására lecsökkent (2. ábra).

Natív poliakrilamid géleken detektáltuk az Aphanizomenon ovalisporum CYN tartalmú nyers kivonatának hatásait a kis-balatoni, csarodai és monostorpályi Lemna minor, L. trisulca, illetve Wolffia arrhiza peroxidáz izoenzimeire (23. ábrák).